Une analyse plus détaillée de l'immunophénotype des cellules T qui infiltrent les tumeurs

Dans cette édition de Tech Spotlight, nous démontrons cette capacité en présentant des données générées à l'aide du nouveau panel Expanded CompT™, un panel de 16 couleurs qui offre à l'analyse de flux de l'activation et de la différenciation des cellules T un niveau supérieur à tout autre panel du portefeuille de services de Covance.

AUTEUR :

David Draper, PhD | Directeur associé, développement scientifique

DATE :

Août 2019

La cytométrie en flux qui utilise de vastes panels d'anticorps présente l'avantage d'examiner un plus grand nombre de sous-ensembles de cellules. Cette capacité est particulièrement importante lorsqu'un ensemble de données exhaustif est requis, mais que peu de matière tumorale est disponible pour les analyses. En outre, les panels présentant un grand nombre d'anticorps peuvent aussi servir à collecter des informations approfondies sur l'immunophénotypage de plusieurs sous-ensembles, ou même à fournir une analyse plus poussée d'un seul sous-ensemble. Dans cette édition de Tech Spotlight, nous démontrons cette capacité en présentant des données générées à l'aide du nouveau panel Expanded CompT™, un panel de 16 couleurs qui offre à l'analyse de flux de l'activation et de la différenciation des cellules T un niveau supérieur à tout autre panel du portefeuille de services de Covance.

Le panel Expanded CompT™ s'appuie sur le panel CompT™, notre panel standard le plus utilisé pour examiner les lymphocytes T CD4+ et CD8+. Ce panel amélioré ajoute des marqueurs de lymphocytes T mémoires et effecteurs, ainsi que quatre marqueurs supplémentaires pour l'analyse de l'activation et de l'épuisement des lymphocytes T. Le tableau 1 décrit les composants du panel Expanded CompT™, et à l'aide d'adénocarcinomes du côlon MC38 murins non traités, la figure 1 illustre sa stratégie d'analyse et de contrôle.

  

Anticorps/coloration Description
CD45 Marqueur des cellules immunitaires
CD3 Marqueur pan-T
CD4 Marqueur des cellules T CD4+
CD8 Marqueur des cellules T CD8+
FoxP3 Marqueur des cellules T régulatrices
CD25 Marqueur des cellules T régulatrices/récepteur IL-2
CD44 Marqueur d'activation/mémoire
CD62L Marqueur de mémoire/cellule T naïve
Ki-67 Marqueur de prolifération
CD69 Marqueur d'activation des cellules T
PD-1 Marqueur d'activation/épuisement des cellules T
LAG-3 Marqueur d'activation/épuisement des cellules T
TIM-3 Marqueur d'épuisement des cellules T
ICOS Marqueur d'activation des cellules T
Granzyme B Marqueur de cytotoxicité anti-tumorale
Colorant de viabilité Exclusion des cellules mortes
Le panel Expanded CompT™ peut être personnalisé pour inclure les marqueurs des cellules NK/NKT (CD49b/CD335) pour permettre l'expression des marqueurs d'activation et du granzyme B dans ces sous-ensembles.


Comme pour tous les panels de lymphocytes T de Covance, l'analyse commence par l'exclusion des cellules mortes, puis la délimitation des cellules immunitaires CD45+ pour séparer les cellules T CD3+ (non visible). La figure 1A montre les critères en aval de l'analyse des cellules T CD4+ et CD8+ partagés par les panels CompT™ et Expanded CompT™. Cela inclut les CD69 et PD-1, en régulation positive dès l'activation des cellules T. Leur expression a été corrélée au phénotype des lymphocytes T épuisés[1]. Un autre critère partagé est la prolifération des cellules T CD8+, obtenues en utilisant l'expression de Ki-67 comme marqueur de substitution. Enfin, les cellules T CD4+ sont examinées pour quantifier les cellules T auxiliaires et les cellules T régulatrices (Tregs). Les figures 1B et 1C montre les critères d'évaluation ajoutés pour développer le panel CompT™, décrits plus en détail ci-dessous.

 

Fig. 1 : analyse des lymphocytes T à l'aide du panel Expanded CompT™
Fig. 1 : analyse des lymphocytes T à l'aide du panel Expanded CompT™. Des tumeurs MC38 naïves ont été récoltées chez des souris C57BL/6. (A) quantification des auxiliaires CD4+, des lymphocytes T CD8+ et des Treg, avec mesure de la prolifération (analyse Ki-67) et expression des marqueurs CD69/PD-1. (B) Analyse des lymphocytes T CD8+ effecteurs/mémoires pour quantifier les sous-ensembles de cellules naïves, Teff, Tem et Tcm. (C) Analyse approfondie des marqueurs d'activation/épuisement des lymphocytes T comme le granzyme B. Les pics rouges représentent les cellules colorées par la cible. Les pics bleus représentent les contrôles négatifs non colorés.


La figure 1B montre l'analyse de la différentiation des cellules T CD8+ effectrices et mémoires. La conversion des cellules T en un phénotype mémoire est importante pour le développement d'une réponse immunologique durable à une réexposition dans le contexte de la pathogenèse du cancer et de l'infection. L'analyse de CD44 et CD62L permet de répartir les lymphocytes T en quatre états de différenciation. Il s'agit des sous-ensembles suivants : les lymphocytes T naïfs ou inactifs, les lymphocytes T effecteurs activés (Teff), les lymphocytes T effecteurs à mémoire (Tem) et les lymphocytes T à mémoire centrale (Tcm). Les sous-ensembles Tem et Tcm peuvent circuler mais ils ont tendance à résider respectivement dans les tissus non-lymphoïdes et lymphoïdes[2]. De récents rapports ont démontré que ces deux sous-ensembles ont des rôles distincts dans la réponse antitumorale. Une troisième population de lymphocytes T mémoires résidents (Trm) a plus récemment été décrite comme jouant un rôle important dans le contrôle de la croissance de la tumeur dans différents modèles et elle peut être délimitée à l'aide du CD103, entre autres marqueurs[3]. Le panel Expanded CompT™ peut être personnalisé pour inclure l'analyse des cellules Trm.

  

Le panel Expanded CompT™ inclut l'analyse de ICOS, LAG-3, TIM-3 et la granzyme B, quatre biomarqueurs qui font l'objet de recherches importantes pour la fonction des lymphocytes T (figure 1C). L'analyse de ces cibles, seule ou combinée, peut fournir des informations sur le potentiel antitumoral des lymphocytes T CD8+. Les données disponibles confirment le rôle co-stimulateur et antitumoral de la signalisation des récepteurs ICOS, faisant ainsi de ces derniers une cible thérapeutique intéressante [4]. La granzyme B est souvent utilisée comme biomarqueur de l'activité cytolytique et peut être corrélée avec les réponses antitumorales des lymphocytes T CD8+. Inversement, PD-1, LAG-3 et TIM-3 sont des récepteurs inhibiteurs et bien que l'expression de ces trois récepteurs ait été liée à l'épuisement des lymphocytes T, de plus en plus de données suggèrent qu'il existe une hétérogénéité entre les sous-populations au sein des PD-1 épuisées exprimant les lymphocytes T CD8+ [5]. Cette hétérogénéité est en corrélation avec le schéma d'expression de ces récepteurs inhibiteurs. Ce profil peut aider à définir différentes sous-populations selon leur potentiel à être revigorées afin de proliférer et/ou de lyser les cellules tumorales [6]. La figure 2 illustre comment le panel Expanded CompT™ peut quantifier les cellules à double et triple expression positive pour les récepteurs inhibiteurs et donner un aperçu du sous-ensemble hétérogène de lymphocytes T exprimant PD-1 et de sa fonction. De nombreux autres récepteurs inhibiteurs et activateurs des lymphocytes T ont été décrits. Ceux-ci, par exemple TIGIT, OX-40, CD137 et CTLA-4 jouent un rôle dans la réponse immunitaire à la tumeur. Covance a de l'expérience dans l'analyse de nombre de ces marqueurs par analyse des tumeurs ex vivo. En le développant un peu, le panel Expanded CompT™ peut être personnalisé pour répondre à vos besoins précliniques propres.

Analyse multiplexe des marqueurs d'activation/épuisement des lymphocytes T dans les cellules dérivées de tumeurs MC38 naïves.
Fig. 2 : analyse multiplexe des marqueurs d'activation/épuisement des lymphocytes T dans les cellules dérivées de tumeurs MC38 naïves. Le panel Expanded CompT™ mesure la coexpression de plusieurs biomarqueurs des lymphocytes T pour l'épuisement et l'activité antitumorale en parallèle. Dans cet exemple, on a d'abord distingué les lymphocytes T  PD1+ CD8+. Ensuite, l'analyse quantifie les cellules à double et triple expression positive de PD-1, LAG-3 et TIM-3.


Covance peut configurer des panels personnalisés avec jusqu'à 18 couleurs, ce qui crée différentes possibilités pour le panel MI-Expanded CompT™. En plus de substituer ou d'ajouter différents marqueurs d'activation/épuisement des lymphocytes T comme décrit dans la section précédente, l'analyse des cellules NK/NKT est un critère d'évaluation potentiellement intéressant. Ceci est permis par l'ajout des marqueurs CD49b/CD335 au panel (figure 3).

  

Fig. 3 : personnalisation du panel Expanded CompT™ pour permettre l'analyse des sous-ensembles de cellules NK et NKT dans des cellules dérivées de tumeurs MC38 naïves. L'expression de CD3 a été utilisée pour delimiter les cellules NK CD49b/CD335+ et les cellules NKT. Les niveaux d'expression de la granzyme B dans ces sous-ensembles ont été quantifiés par une analyse ultérieure.
Fig. 3 : personnalisation du panel Expanded CompT™ pour permettre l'analyse des sous-ensembles de cellules NK et NKT dans des cellules dérivées de tumeurs MC38 naïves. L'expression de CD3 a été utilisée pour delimiter les cellules NK CD49b/CD335+ et les cellules NKT. Les niveaux d'expression de la granzyme B dans ces sous-ensembles ont été quantifiés par une analyse ultérieure.

 

Les cellules NK et NKT sont une source importante de IFNγ, ont des effets indirects sur l'amélioration des réponses antitumorales des lymphocytes T CD8+ et peuvent lyser directement les cellules tumorales en libérant des granules cytolytiques tels que la granzyme B[7,8]. Il est également possible d'utiliser les analyses de IFNγ, TNFα ou d'autres cytokines pour un profil plus approfondi des lymphocytes T PD1+ et PD1- CD8+. Vous pouvez aussi ajouter l'analyse de CD103 pour examiner les lymphocytes T mémoires résidents pour approfondir le profil des lymphocytes T mémoires dans la tumeur. L'équipe de Covance a une vaste expérience dans le développement de services de cytométrie en flux personnalisés. Pour en savoir plus sur les façons dont vous pouvez incorporer le panel Expanded CompT™ dans votre recherche préclinique, contactez les scientifiques de Covance.

1Jiang, Y., Y. Li et B. Zhu. "T-cell exhaustion in the tumor microenvironment." Cell death & disease 6,6 (2015): e1792.

2Klebanoff, Christopher A., Luca Gattinoni et Nicholas P. Restifo. “CD8+ T‐cell memory in tumor immunology and immunotherapy.” Immunological reviews 211,1 (2006): 214-224

3Mami-Chouaib, Fathia, et al. “Resident memory T cells, critical components in tumor immunology.” Journal for immunotherapy of cancer 6,1 (2018): 87.

4Amatore, Florent, Laurent Gorvel et Daniel Olive. "Inducible Co-Stimulator (ICOS) as a potential therapeutic target for anti-cancer therapy." Expert opinion on therapeutic targets 22,4 (2018): 343-351.

5Miller, Brian C., et al. “Subsets of exhausted CD8+ T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.” Nature immunology 20,3 (2019): 326.

6Xiong, Huizhong, et al. “Coexpression of Inhibitory Receptors Enriches for Activated and Functional CD8+ T Cells in Murine Syngeneic Tumor Models.” Cancer immunology research 7,6 (2019): 963-976.

7Zhu, Yanting, Bo Huang et Jue Shi. "Fas ligand and lytic granule differentially control cytotoxic dynamics of natural killer cell against cancer target." Oncotarget 7,3 (2016): 47163.

8Zhao, Jie, et al. “Polyclonal type II natural killer T cells require PLZF and SAP for their development and contribute to CpG-mediated antitumor response.” Proceedings of the National Academy of Sciences 111,7 (2014): 2674-2679.

 

Remarques : les études ont été réalisées conformément aux réglementations applicables pour le bien-être animal et dans un centre agréé par l'AAALAC.