Comptage absolu par cytométrie en flux - Optimisez la précision de votre interprétation des données immunophénotypiques

Dans cette édition de Tech Spotlight, nous allons présenter les principes du comptage absolu et les avantages de ce service combiné à l'analyse immunophénotypique des tumeurs.

AUTEUR :

David Draper, PhD | Directeur associé, développement scientifique

DATE :

 Juillet 2018

Le comptage absolu est une application qui permet aux scientifiques spécialistes de cytométrie en flux de quantifier le nombre total de cellules dans un tissu. Il peut servir pour mesurer l'infiltration d'une tumeur par les cellules immunitaires. Dans cette édition de Tech Spotlight, nous allons présenter les principes du comptage absolu et les avantages de ce service combiné à l'analyse immunophénotypique des tumeurs.

La capacité à mesurer précisément les changements dynamiques de la réponse immunitaire dans le microenvironnement de la tumeur (TME) est essentielle lors de l'essai de nouvelles thérapies de modulation immunitaire. Si la configuration de panels d'immunophénotypage solides est nécessaire pour délimiter les sous-ensembles avec précision, la méthode utilisée pour rapporter ces critères d'évaluation peut avoir un impact sur la façon dont les données sont finalement interprétées. Une lecture courante est le « % de cellules CD45+ », qui mesure la distribution relative de chaque sous-ensemble en pourcentage des cellules immunitaires totales1,2. Cette méthode est précieuse car elle aide à quantifier l'effet de la thérapie sur la proportion de sous-ensembles ayant différentes activités pro-tumorales et anti-tumorales. Par exemple, une augmentation de la proportion de lymphocytes T CD8+ avec une diminution correspondante des lymphocytes T régulateurs indique que le traitement a réduit l'immunosuppression par les lymphocytes T régulateurs dans le TME.

L'utilisation de mesures de distribution comme seule lecture a cependant ses limites. C'est ce que montre l'exemple ci-dessous. Dans cette étude, des souris porteuses de tumeurs CT26 ont été traitées avec un inhibiteur de point de contrôle anti-mCTLA-4 qui a entraîné une inhibition marquée de la croissance tumorale (figure 1). Pour examiner le mécanisme d'action, nous avons d'abord utilisé la cytométrie en flux afin de définir la distribution des cellules CD3+ et CD11b+ (lymphocytes T et cellules myéloïdes, respectivement) dérivées de la tumeur parmi les cellules CD45+ totales (voir figure 2). L'interprète pourrait conclure de ces données que le blocus du CTLA-4 a déclenché à la fois une augmentation du nombre de lymphocytes T et une diminution simultanée des cellules myéloïdes. Cela suggèrerait que l'activité mécanique du traitement passe par une expansion du nombre de lymphocytes T CD8+ anti-tumoraux ainsi que par une contraction des cellules myéloïdes immuno-suppressives. Comme vous pouvez le voir ci-dessous, cette conclusion serait erronée.

  

Fig. 1 : des cellules CT26 ont été implantées en sous-cutanées sous l'aisselle droite de souris Balb/c. Le dosage de n=10 animaux/groupe a été initié une fois les tumeurs établies, et la progression de la tumeur a été suivie par des mesures de calibre. Les doses d'anticorps ont été administrées deux fois par semaine avant l'échantillonage, le jour 14.
Fig. 1 : des cellules CT26 ont été implantées en sous-cutanées sous l'aisselle droite de souris Balb/c. Le dosage de n=10 animaux/groupe a été initié une fois les tumeurs établies, et la progression de la tumeur a été suivie par des mesures de calibre. Les doses d'anticorps ont été administrées deux fois par semaine avant l'échantillonage, le jour 14.

 

Le calcul en tandem des nombres absolus est souvent utilisé pour surmonter la limite décrite ci-dessus. Ce critère, qui mesure avec précision l'infiltration des tumeurs par les sous-ensembles immunitaires, est généralement exprimé en nombre total de cellules par unité de masse3,4,5. Lorsque l'on ajoute les nombres absolus à l'étude ci-dessus, il devient clair qu'en fait, le nombre total de cellules myéloïdes/gramme de tumeur n'a pas changé suite au traitement par anti-mCTLA-4 (figure 2). Au contraire, la diminution observée de la proportion de cellules myéloïdes est plus probablement causée par l'augmentation démontrée du nombre absolu de lymphocytes T. Ce qu'il faut en retenir, c'est que lorsqu'une thérapie est à l'origine d'un changement dans la distribution d'un sous-ensemble cible, ce changement n'est pas nécessairement dû à une évolution des nombres absolus de ce sous-ensemble de cellules et peut plutôt se produire en conséquence de l'expansion ou de la contraction d'un sous-ensemble différent.

  

Fig. 2 : mesure de la distribution et mesure du nombre absolu de lymphocytes T et de cellules myéloïdes dans des tumeurs CT26. L'analyse statistique a été réalisée suivant un test t de Student (*p<0,05).
Fig. 2 : mesure de la distribution et mesure du nombre absolu de lymphocytes T et de cellules myéloïdes dans des tumeurs CT26. L'analyse statistique a été réalisée suivant un test t de Student (*p<0,05).

 

L'analyse immunophénotypique postérieure des macrophages associés aux tumeurs (TAM : tumor-associated macrophages) et des sous-ensembles de lymphocytes T souligne encore l'intérêt d'inclure des critères de comptage absolu. Comme l'illustre la figure 3, bien que l'analyse ait révélé que la proportion de TAM M2 a diminué dans la tumeur, les nombres absolus restent inchangés. Par conséquent, contrairement à l'analyse initiale, les nombres absolus n'indiquent pas que la pharmacodynamique des TAM M2 contribue à l'efficacité globale dans cette étude. Ceci est une conclusion plus fiable à partir des données disponibles. Enfin, la thérapie anti-mCTLA-4 a déclenché une augmentation du nombre absolu de lymphocytes T CD8+ et de lymphocytes T CD4+ auxiliaires. Prises ensemble, ces données montrent à quel point les nombres absolus peuvent être essentiels pour quantifier avec précision le nombre total de cellules pour les sous-ensembles dérivés de tissus.

  

Fig. 3 : mesure de la distribution et mesure du nombre absolu de TAM M1 et M2, lymphocytes T CD8+ et lymphocytes T CD4+ auxiliaires dans des tumeurs CT26. L'analyse statistique a été réalisée suivant un test t de Student (*p<0,05).
Fig. 3 : mesure de la distribution et mesure du nombre absolu de TAM M1 et M2, lymphocytes T CD8+ et lymphocytes T CD4+ auxiliaires dans des tumeurs CT26. L'analyse statistique a été réalisée suivant un test t de Student (*p<0,05).

L'analyse immunophénotypique postérieure des macrophages associés aux tumeurs (TAM : tumor-associated macrophages) et des sous-ensembles de lymphocytes T souligne encore l'intérêt d'inclure des critères de comptage absolu. Comme l'illustre la figure 3, bien que l'analyse ait révélé que la proportion de TAM M2 a diminué dans la tumeur, les nombres absolus restent inchangés. Par conséquent, contrairement à l'analyse initiale, les nombres absolus n'indiquent pas que la pharmacodynamique des TAM M2 contribue à l'efficacité globale dans cette étude. Ceci est une conclusion plus fiable à partir des données disponibles. Enfin, la thérapie anti-mCTLA-4 a déclenché une augmentation du nombre absolu de lymphocytes T CD8+ et de lymphocytes T CD4+ auxiliaires. Prises ensemble, ces données montrent à quel point les nombres absolus peuvent être essentiels pour quantifier avec précision le nombre total de cellules pour les sous-ensembles dérivés de tissus.

  

Fig. 4 : stratégie de gating pour mesurer le volume d'échantillon aspiré, le nombre absolu du total de cellules vivantes et les cellules CD45+ vivantes, à l'aide du panel en flux de comptage absolu de Covance.
Fig. 4 : stratégie de gating pour mesurer le volume d'échantillon aspiré, le nombre absolu du total de cellules vivantes et les cellules CD45+ vivantes, à l'aide du panel en flux de comptage absolu de Covance.

 

La figure 4 montre comment le nombre absolu de cellules est calculé. La région des billes quantifie le nombre de billes acquises par le cytomètre en flux pour permettre la mesure du volume de l'échantillon qui est aspiré. La séparation des cellules est analysée à l'aide d'un colorant de viabilité, qui exclut les cellules mortes. Et après exclusion des cellules mortes, l'expression des CD45 est mesurée pour calculer le pourcentage de cellules qui tombent dans le domaine des cellules CD45+ vivantes. Le nombre total de cellules immunitaires CD45+ détectées par le cytomètre est ensuite calculé à l'aide de la formule ci-dessous. Enfin, comme la masse de départ de la tumeur est connue, le nombre de cellules/gramme de la tumeur peut être calculé a posteriori.

  

Équation de comptage absolu

 

L'ensemble de données complet de l'étude ci-dessus est disponible sur demande. Il décrit les effets du blocage des points de contrôle sur le nombre et le profil des sous-ensembles suivants dans les tumeurs CT26 ; ainsi que les panels de flux qui ont été utilisés pour effectuer ces mesures.

  • Cellules myéloïdes suppressives granulocytaires

  •  Cellules myéloïdes suppressives monocytaires

  • Cellules dendritiques

  • Macrophages associés aux tumeurs (M1 et M2)

  • Lymphocytes B

  • Cellules NK

  • Lymphocytes T NK

  • Lymphocytes T CD8+

  • Lymphocytes T CD4+ auxiliaires

  • Lymphocytes T régulateurs

Contactez les scientifiques de Covance pour demander l'ensemble de données complet ou pour en savoir plus sur notre service de comptage absolu et la façon dont il peut être appliqué à votre recherche préclinique.

1Kadić, Elma, et al. “Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determined by multiparametric single cell mass cytometry analysis.” BMC immunology 18,1 (2017): 6.

2Lewis, Katherine E., et al. “Interleukin-21 combined with PD-1 or CTLA-4 blockade enhances antitumor immunity in mouse tumor models.” Oncoimmunology 7,1 (2018): e1377873.

3Muroyama, Yuki, et al. “Stereotactic radiotherapy increases functionally suppressive regulatory T cells in the tumor microenvironment.” Cancer immunology research 5,11 (2017): 992.

4Balza, Enrica, et al. “The therapeutic T‐cell response induced by tumor delivery of TNF and melphalan is dependent on early triggering of natural killer and dendritic cells.” European journal of immunology 47,4 (2017): 743-753.

5Buisseret, Laurence, et al. “Tumor-infiltrating lymphocyte composition, organization and PD-1/PD-L1 expression are linked in breast cancer.” Oncoimmunology 6,1 (2017): e1257452.


Remarques : les études ont été réalisées conformément aux réglementations applicables pour le bien-être animal et dans un centre agréé par l'AAALAC.