Analyse de cellules dendritiques complète par cytométrie en flux à l'aide du nouveau panel CompDC™

Date : février 2019

Author: David Draper, PhD | Associate Director, Scientific Development

Pour répondre au besoin croissant d'un immunophénotypage CD complet et robuste dans des modèles précliniques murins, Covance a configuré un nouveau panel standard, CompDC™. Dans cette présentation des technologies, nous montrerons comment divers sous-groupes de CD dans des échantillons de tumeurs ainsi que d'autres échantillons de cellules dérivées de tissus peuvent être analysés à l'aide de ce panel.

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Les réponses anti-tumorales à médiation par les cellules T dépendent de l'activité des cellules présentatrices d'antigène (CPA) qui présentent l'antigène associé à la tumeur (AAT) et envoient des signaux co-stimulants aux lymphocytes T. Ceci active ensuite les lymphocytes T spécifiques à la tumeur, déclenchant leur expansion et leur recrutement vers la tumeur sur laquelle ils agissent. Les cellules dendritiques (CD) sont des CPA essentielles dans ce processus. Les CD peuvent être activées pour exprimer de nombreux ligands costimulateurs et peuvent internaliser l'antigène et présenter des peptides immunodominants à la fois aux lymphocytes T CD4+ et CD8+. Le développement de nouvelles solutions thérapeutiques qui utilisent la fonction des CD est un domaine d'investigations intensives. Pour faciliter ces efforts et répondre au besoin croissant d'un immunophénotypage des CD complet et robuste dans des modèles précliniques murins, Covance a configuré un nouveau panel standard, CompDC™. Dans cette présentation des technologies, nous montrerons comment divers sous-groupes de CD dans des échantillons de tumeurs ainsi que d'autres échantillons de cellules dérivées de tissus peuvent être analysés à l'aide de ce panel.

For a general introduction to the different DC subsets and their function in cancer biology, read our blog “An Introduction to Dendritic Cell Biology and Analysis Using Syngeneic Immuno-Oncology Models” 

Le panel CompDC™ permet aux chercheurs de déterminer si la thérapie in vivo affecte l'abondance et l'état d'activation des différents sous-ensembles de CD dans la tumeur, les ganglions lymphatiques (GL) drainant la tumeur ou d'autres éléments chez l'hôte. Il s'agit d'un panel de 12 couleurs qui combine un ensemble d'anticorps qui, lorsqu'ils sont correctement examinés, délimitent des sous-ensembles distincts de CD, et donne un aperçu du potentiel d'activation des cellules T des CD (tableau 1). Grâce à une stratégie de gating méticuleuse, le panel facilite d'abord l'analyse des CD avec précision en excluant les macrophages, les granulocytes et les cellules B à l'aide d'un système d'exclusion. Ce processus minimise le risque de compromettre l'analyse des CD suite à la contamination par des cellules non pertinentes ou autofluorescentes. L'expression des CD24 est ensuite utilisée pour aider à délimiter les sous-ensembles de CD conventionnels, qui sont généralement classés par niveaux d'expression moyens à élevés de CD11c et CMH de classe II. Ces CD conventionnelles comprennent le sous-ensemble DC1 CD103+/CD8+ et le sous-ensemble DC2 CD11b+ (figure 1A), dont il a été démontré qu'ils entraînent respectivement les réponses anti-tumorales des lymphocytes T CD8+ et CD4+ [1]. L'expression de XCR1 a été documentée par de multiples groupes comme marqueur des CD avec une activité de présentation croisée, un phénotype nécessaire à l'activation des lymphocytes T CD8+ par les CD[2]. Les figures 1B et 1C montrent l'analyse des CD XCR1+ dans les cellules B16-F10 dérivées de tumeurs et les ganglions lymphatiques en cours de drainage. On peut voir que l'expression de XCR1 est généralement associée au sous-ensemble DC1. Enfin, l'expression des marqueurs de maturité CD80 et CD86 est mesurée pour évaluer le potentiel de co-stimulation des lymphocytes T des CD. La figure 1D montre que l'expression de ces marqueurs est relativement faible sur les CD dans les tumeurs de mélanome B16-F10, ce qui indique l'immunosuppression conférée aux CD par le microenvironnement de la tumeur (TME).

Tableau 1 : anticorps du panel CompDC™ et description de leur utilité

Anticorps/coloration Description  
CD45 Marqueur des cellules immunitaires  

F4/80, Ly-6G, CD19

Exclusion des macrophages, granulocytes et cellules B  
CD11c Marqueur des cellules dendritiques  
CD24 Marqueur des cellules dendritiques  
CD8 Marqueur DC1  
CMH de classe II Marqueur des cellules dendritiques/marqueur de maturité  
CD103 Marqueur DC1  
CD11b Marqueur DC2  
XCR1 Marqueur des cellules dendritiques migrantes/à présentation croisée  
CD80 Marqueur de maturité  
CD86 Marqueur de maturité  
Colorant de viabilité Exclusion des cellules mortes  
CompDC™ peut être personnalisé pour analyser les sous-ensembles de CD inflammatoires (InfDC) et de CD plasmacytoïdes en remplaçant les anticorps Ly-6C/CD206 et Siglec-H respectivement.  
Fig. 1 : analyse des sous-ensembles de CD à l'aide du panel CompDC™. Les tumeurs de type mélanome B16-F10 ont été prélevées sur des souris. Analyse des sous-ensembles DC1 et DC2 dans les cellules dérivées de la tumeur (A), expression de XCR1 dans les cellules DC1 CD103+  de la tumeur (B), et ganglions lymphatiques (GL) des souris  porteuses de la tumeur B16-F10 (C). Expression des marqueurs de costimulation CD80 et CD86 dans le total des CD dérivées des tumeurs (D). Le pic rouge représente les cellules colorées par la cible. Le pic bleu représente le contrôle négatif non coloré.

Fig. 1 : analyse des sous-ensembles de CD à l'aide du panel CompDC™. Les tumeurs de type mélanome B16-F10 ont été prélevées sur des souris. Analyse des sous-ensembles DC1 et DC2 dans les cellules dérivées de la tumeur (A), expression de XCR1 dans les cellules DC1 CD103+ de la tumeur (B), et ganglions lymphatiques (GL) des souris porteuses de la tumeur B16-F10 (C). Expression des marqueurs de costimulation CD80 et CD86 dans le total des CD dérivées des tumeurs (D). Le pic rouge représente les cellules colorées par la cible. Le pic bleu représente le contrôle négatif non coloré.
 

CompDC™ peut également être personnalisé pour analyser deux sous-ensembles supplémentaires. Cela inclut les CD inflammatoires (infDC), ce qui est réalisé par substitution dans les anticorps anti-CD206 et anti-Ly-6C. Il a été montré que les InfDC favorisent l'activité anti-tumorale et peuvent être délimitées à partir de l'ensemble des cellules suppressives dérivées de la myéloïde monocytique (M-MDSC) comme des cellules CD11c+MHCII+CD11b+CD206+ (Figure 2A) [3]. Les CD plasmacytoïdes (pDC) peuvent également être quantifiés par substitution dans un anticorps anti-Siglec-H. Bien que la fonction des pDC dans le TME n'ait pas été entièrement caractérisée, de nombreux rapports ont démontré que ces pDC peuvent avoir une fonction perturbatrice et peuvent même avoir un effet immunosuppresseur sur les réponses anti-tumorales[4]. Les pDC ont généralement de faibles niveaux d'expression de CD11c et sont positifs pour Siglec-H, comme le montre la figure 2B.

Fig. 2 : analyse des sous-ensembles infDC et pDC grâce à la personnalisation du panel CompDC™. (A) Analyse des infDC dans des cellules dérivées de la tumeur B16-F10. (B) Analyse des pDC dans des cellules dérivées d'un carcinome colorectal CT26.

Fig. 2 : analyse des sous-ensembles infDC et pDC grâce à la personnalisation du panel CompDC™. (A) Analyse des infDC dans des cellules dérivées de la tumeur B16-F10. (B) Analyse des pDC dans des cellules dérivées d'un carcinome colorectal CT26.

To learn more about the CompDC™ panel and how to incorporate it into your research, contact the scientists at Labcorp.

Références


1Gardner, A. et Ruffell, B. (2016). Dendritic cells and cancer immunity. Trends in immunology, 37(12), 855-865.

2Wylie, B., Seppanen, E., Xiao, K., Zemek, R., Zanker, D., Prato, S., … et Waithman, J. (2015). Cross-presentation of cutaneous melanoma antigen by migratory XCR1+ CD103− and XCR1+ CD103+ dendritic cells. Oncoimmunology4(8), e1019198.

3Kuhn, S., Yang, J. et Ronchese, F. (2015). Monocyte-derived dendritic cells are essential for CD8+ T cell activation and antitumor responses after local immunotherapy. Frontiers in immunology6, 584. 

4Mitchell, D., Chintala, S. et Dey, M. (2018). Plasmacytoid dendritic cell in immunity and cancer. Journal of neuroimmunology.

Remarque : Veuillez noter que toute la prise en charge des animaux et l'utilisation de ceux-ci ont été effectuées conformément à la réglementation sur le bien-être des animaux dans un établissement accrédité par l'AAALAC, avec examen et approbation du protocole de l'IACUC.

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