Déterminer la persistance des cellules CAR-T en phase préclinique par cytométrie en flux

Lors de la recherche et du développement préclinique, les thérapies à base de cellules CAR-T (chimeric antigen receptor) sont souvent étudiées sur des souris. Dans ce contexte, des souris immunodéprimées portent une charge tumorale d'origine humaine et reçoivent une dose de cellules CAR-T humaines allogéniques. Le récepteur d'antigénique chimérique modifié envoie les cellules faisant l'objet du transfert adoptif se lier à un antigène de surface sur une cellule tumorale (CD19 par exemple). Grâce à la liaison du lymphocyte T modifié à la cellule tumorale, le lymphocyte T s'active et tue les cellules tumorales dans un CMH non restreint. Dans les études de recherche préclinique, un certain nombre de paramètres prédéfinis sont suivis chez les souris, pour évaluer la croissance et la charge tumorale et déterminer ainsi l'efficacité des cellules CAR-T. (En savoir plus sur la détermination de l'efficacité à l'aide de l'imagerie par bioluminescence (BLI)

Un facteur clé de succès de la réponse antitumorale des cellules CAR-T est la durée d'existence de ces cellules après implantation dans l'hôte (persistance). Même pour des cellules pleinement fonctionnelles, il a été démontré qu'une faible persistance des cellules CAR-T peut limiter l'efficacité de la réponse antitumorale. 1  Dans le cadre clinique, une rémission à long terme chez les patients atteints d'hémopathies malignes est associée à une persistance soutenue des cellules CAR-T.2 On pense que la signalisation co-stimulante influence l'expansion et la persistance des lymphocytes T. Les études précliniques examinant l'efficacité des constructions CAR conçues pour inclure le domaine de co-stimulation 4-1BB ont été associées à une longue persistance des cellules CAR-T, une fonction effectrice plus lente et plus soutenue et une proportion plus élevée de lymphocytes T mémoire.3 L'évaluation de la persistance des cellules CAR-T dans les études précliniques peut aider à déterminer le succès clinique.

Cette présentation de la technologie fournira au lecteur des informations sur les techniques de mesure de persistance des cellules CAR-T par cytométrie en flux en phase préclinique.

Modèles murins pour l'évaluation de cellules CAR-T candidates

En septembre 2017, la FDA a autorisé la première thérapie à base de cellules CAR-T. Cette thérapie cellulaire est commercialisée par Novartis sous le nom de Kymriah. Kymriah est également connu sous le nom de tisagenlecleucel et a été approuvé pour les enfants et les jeunes adultes qui ne répondent plus aux thérapies standard pour la leucémie aiguë lymphoblastique à cellules B. Kymriah s'appuie sur les travaux de Carl June, PhD., à l'université de Pennsylvanie sur des souris NSGTM.

La souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, connue communément sous le nom de marque NOD scid gamma (NSG™), n'exprime pas le gène Prkdc, ni le gène Il2rg lié à l'X. La mutation scid (sigle anglais du déficit immunitaire combiné sévère) se trouve dans la protéine Prkdc du complexe de réparation de l'ADN et crée un manque de cellules B et T chez ces souris. Ces souris n'ont ni système du complément ni cellules NK et présentent des déficiences au niveau des voies de signalisation des cytokines. Ces déficiences font de ces souris un animal idéal et très propice à la greffe de cellules immunitaires humaines, y compris les cellules CAR-T. On peut greffer de nombreuses tumeurs humaines sur ces souris, ce qui en fait le modèle de référence pour la recherche préclinique sur les cellules CAR-T.

Dans nos services d'oncologie préclinique, nous pouvons utiliser toute souche de souris disponible dans le commerce pour la thérapie par cellules CAR-T et d'autres études de transfert adoptif de cellules, y compris les souris NSGTM et, sous certaines conditions, nous pouvons également accepter des souris spécialisées.

Le panel PersistenceTTM des services d'oncologie préclinique, utilisé pour obtenir des données longitudinales sur la persistance des cellules CAR-T, fonctionne avec des doses réduites, dès 5 μL de sang total. Il prend la forme d'un test de lyse/sans lavage avec comptage absolu. Ce panel s'adapte au contexte, offrant l'opportunité d'ajouter des sondes anti-CAR dans les canaux FITC, PE et APC. Des souris NSG du Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, États-Unis) ont reçu 2x107 PBMC humaines, du sang total a été prélevé 7, 14 et 21 jours après l'administration et évalué à l'aide du panel PersistenceTTM.

Le tableau 1 décrit les réactifs utilisés dans le panel de PersistenceTTM. La stratégie de gating est détaillée à la figure 1.

Anticorps/coloration

Description

mCD45

Cellules pan-hématopoïétiques de souris

hCD45

Cellules pan-hématopoïétiques humaines

hCD3

Marqueur pan-T humain

hCD4

Marqueur des cellules T CD4+ humaines

hCD8

Marqueur des cellules T CD8+ humaines

Billes de comptage

Fournit un comptage absolu

Colorant de viabilité

Exclusion des cellules mortes

Facultatif : spécifique aux CAR

FITC, PE ou APC

Tableau 1 : panel PersistenceTTM d'anticorps et description de leur utilisation.

 

fichier
Tableau 1 : analyse de lymphocytes T humains avec le panel PersistenceTTM. La stratégie de gating commence par la double exclusion (A) puis continue avec la fluorescence des billes et le point de comptage des billes (B). Ensuite, les débris sont exclus (C) et les cellules murines sont différenciées das cellules humaines grâce à des anti-CD45 murins avec des anti-CD45 humaines (D). Les lymphocytes T humains sont isolés par gating anti CD3 humaines (E) et finalement, le nombre de lymphocytes T CD8+ et CD4+ humains est déterminé (F).

Caractérisation immunophénotypique longitudinale des cellules CAR-T à l'aide du panel PersistenceTTM

Dans le cadre clinique oncologique, l'expansion et la persistance des cellules CAR-T sont corrélées à la réponse et à l'obtention d'une rémission chez les patients4. C'est pour cela qu'il est particulièrement important d'établir des méthodes fiables de suivi du nombre de cellules CAR-T, non seulement pour estimer l'efficacité de la thérapie par cellules CAR-T, mais aussi pour évaluer la sécurité dans le cadre préclinique. Des effets secondaires graves de la thérapie clinique des cellules T CAR ont été remarqués, l'un des plus graves étant le syndrome de libération de cytokines (SLC), associé à l'expansion des cellules CAR-T in vivo.5 

Le panel PersistenceTTM est directement applicable à l'évaluation du nombre de cellules CAR-T humaines dans des échantillons prélevés sur les souris au fil du temps. En raison des faibles besoins en sang total, des échantillons peuvent être prélevés sur la même souris plusieurs fois ou en utilisant des cohortes de souris pour atteindre les objectifs de l'étude. Les souris NSG peuvent être placées sur des études de longue durée pour une évaluation ciblée de la persistance des cellules CAR-T. La figure 2 montre un exemple de la manière dont le panel PersistenceTTM peut être utilisé pour mesurer les lymphocyctes T humains chez les souris NSG au fil du temps.

Figure 2. Mesure de la persistence des lymphocytes T humains chez les souris sur 21 jours.
Figure 2. Mesure de la persistence des lymphocytes T humains chez les souris sur 21 jours.

Améliorer la persistence des cellules CAR-T

La persistance in vivo des cellules CAR-T est un marqueur de substitution de l'efficacité clinique à long terme de la thérapie par cellules CAR-T. Des études ont montré que certaines cellules CAR-T contenant un domaine costimulateur CD28 présentent une expression accrue des gènes liés à l'épuisement des lymphocytes T, tandis que le domaine costimulateur 4-1BB (TNFSF9) avec la même spécificité antigénique réduit le phénotype épuisé. Cela pourrait expliquer pourquoi, dans les essais cliniques réalisés sur des patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique récidivante ou réfractaire, on a constaté que les cellules CAR-T exprimant un domaine CD28 persistent jusqu'à 3 mois, tandis que les cellules CAR-T avec un domaine 4-1BB persistent jusqu'à 5 ans et plus de 6 mois dans presque tous les cas qui ont pu être évalués6.

Les cellules CAR-T à travers les générations

Les cellules CAR-T continuent à évoluer après la modification du récepteur antigénique chimérique. Chaque cellule CAR-T a une scFv (fragments variables à chaÎne unique). Le scFv est une combinaison de la région variable des domaines VH et VL. Un scFv est une protéine de fusion de VH et VL des immunoglobulines, reliée à un court peptide de liaison entre les acides aminés 10 et 25.

Les cellules CAR de première génération ont un domaine de liaison extracellulaire, une région charnière, un domaine transmembranaire et un ou plusieurs domaines de signalisation intracellulaire. Toutes les cellules CAR-T ont le domaine de chaîne CD3 ζ pour la signalisation intracellulaire, transmetteur principal des signaux d'activation des lymphocytes T. C'est l'ajout d'un domaine costimulateur (CD28 ou 4-1BB) qui définit les cellules CAR de deuxième génération. Cela avait pour objectif d'améliorer la prolifération des cellules T, la sécrétion de cytokines et la persistance in vivo.

Les données précliniques montrent que les cellules CAR de troisième génération ont une meilleure fonction effective et une plus grande persistance in vivo que les CAR de deuxième génération. Les cellules CAR de troisième génération ont plusieurs domaines de costimulation (CD28-41BB ou CD28-OX40). Les CAR armées ou TRUCK (cellules CAR T redirected for universal cytokine killing) sont des noms parfois utilisés pour les cellules T-CAR de quatrième génération. Les cellules CAR-T de quatrième génération peuvent inclure des facteurs qui améliorent l'expansion des lymphocytes T, leur activité antitumorale et leur persistance7.

Quelle que soit la génération des cellules CAR ou TRUCK, le panel PersistenceTTM offre un excellent outil pour le suivi à court ou long terme de la persistance des cellules CAR-T in vivo en milieu préclinique.

Résumé

Avec le panel PersistenceT TM des services d'oncologie préclinique de Covance, vous pouvez mesurer facilement la persistance des cellules CAR-T. Notre panel par cytométrie en flux permet de déterminer la persistance longitudinale des cellules CAR-T à partir d'un volume de sang minime. Notre panel Human CompT TM (tableau 2) est un excellent exemple de la façon dont d'autres panels pertinents peuvent être ajoutés à une étude préclinique des cellules CAR-T pour générer un ensemble exhaustif de données par cytométrie en flux.


Anticorps/coloration

Description

hCD45

Cellules pan-hématopoïétiques humaines

hCD3

Marqueur pan-T humain

hCD4

Marqueur des cellules T CD4+ humaines

hCD8

Marqueur des cellules T CD8+ humaines

hCD25

Marqueur des cellules T régulatrices humaines

hFoxP3

Marqueur des cellules T régulatrices humaines

hPD-1

Protéine de signalisation inhibitrice des lymphocytes T humains

hCD69

Marqueur d'activation

Ki-67

Marqueur de prolifération

Colorant de viabilité

Exclusion des cellules mortes

Tableau 2. Marqueurs individuels du panel de leucocytes Human CompTTM.

 

Pour savoir comment le panel PersistenceTTM , ou un autre de nos panels de cytométrie en flux, peut être intégré à votre recherche en oncologie préclinique et pour en savoir plus sur notre vaste programme de cytométrie en flux, contactez nos scientifiques.

Veuillez noter que toute la prise en charge des animaux et l'utilisation de ceux-ci ont été effectuées conformément à la réglementation sur le bien-être des animaux dans un établissement accrédité par l'AAALAC, avec examen et approbation du protocole de l'IACUC.


1Song DG, Ye Q, Carpenito C, Poussin M, Wang LP, Ji C, Figini M, June CH, Coukos G, Powell DJ Jr.  In vivo persistence, tumor localization, and antitumor activity of CAR-engineered T cells is enhanced by costimulatory signaling through CD137 (4-1BB).

Cancer Res. Juil. 2011, 1;71(13):4617-27.

2Maude SL, Frey N, Shaw PA, Aplenc R, Barrett DM, Bunin NJ, et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med. 2014;371(16):1507–17. 

3Long AH, Haso WM, Shern JF, Wanhainen KM, Murgai M, Ingaramo M, et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nat Med. 2015;21:581–90.

4Porter DL, Hwang WT, Frey NV, Lacey SF, Shaw PA, Loren AW, et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Sci Transl Med. 2015;7(303):303ra139. 

5Santomasso B, Bachier C, Westin J, Rezvani K, Shpall EJ.  The Other Side of CAR T-Cell Therapy: Cytokine Release Syndrome, Neurologic Toxicity, and Financial Burden.

Am Soc Clin Oncol Educ Book. janv. 2019 ; 39:433-444. 

6Maus MV and June CH.  Making Better Chimeric Antigen Receptors for Adoptive T-cell Therapy. Clin Cancer Res. 2016 Avril 15 ; 22(8): 1875-1884.

7Chmielewski M, Abken H. TRUCKs: the fourth generation of CARs. Expert Opin Biol Ther. 2015;15(8):1145-54. 


AUTEUR :

Mark J Cameron | Directeur du développement scientifique 

DATE :

Novembre 2020

 

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