Analyse fonctionnelle des lymphocytes infiltrant la tumeur par cytométrie en flux grâce au pannel Cytokine/Cytotoxicity™

AUTEUR :

David Draper, PhD

DATE :

Août 2020

Les réponses cytokines pro-inflammatoires couplées à l'expression de la granzyme B et de la CD107a (LAMP-1), sont des biomarqueurs précieux dans le domaine de l'immuno-oncologie1-3. Les dosages cellulaires qui peuvent quantifier l'expression de ces cibles dans les lymphocytes effecteurs dérivés de tumeurs permettent de mieux comprendre le mécanisme d'action des médicaments candidats. Le groupe d'oncologie préclinique de Covance propose un nouveau dosage en série qui utilise le panel de cytométrie en flux standard Cytokine/Cytotoxicity pour quantifier ces critères dans les lymphocytes T, les sous-ensembles de cellules tueuses naturelles (NK) et lymphocytes T tueurs naturels (NKT). Cette présentation de la technologie montre comment le panel Cytokine/Cytotoxicity™ peut être intégré dans des études in vivo et, combiné avec l'immunophénotypage conventionnel, aider à construire des ensembles de données robustes pendant le développement préclinique des médicaments.

Les cytokines, notamment IFNγ, TNFα, et IL-2, ont une activité anti-tumorale en favorisant l'activation des cellules immunitaires innées et adaptatives et la prolifération des lymphocytes T dans le microenvironnement de la tumeur.Les thérapies in vivo  qui inhibent la croissance des tumeurs par activation des lymphocytes T, par des mécanismes directs ou indirects, augmentent souvent la fréquence des lymphocytes T qui infiltrent la tumeur et qui sont amorcés pour répondre vigoureusement à la stimulation ex vivo. Il a été démontré que des effets similaires se produisent dans les cellules NK et NKT en ce qui concerne l'amorçage et la production ultérieure de IFNγ/IFNγ. En plus de la production de cytokines, le traitement in vivo peut inciter les lymphocytes effecteurs à acquérir des propriétés cytotoxiques accrues qui permettent la lyse des cellules tumorales par des mécanismes de contact direct de cellule à cellule. Ce processus est provoqué par l'expression et la libération de perforines et de granzymes à partir de granules cytolytiques stockées dans les cellules immunitaires. Ces toxines perturbent la membrane cellulaire et provoque l'apoptose de la cellule tumorale cible. De plus, la dégranulation coïncide avec l'expression de CD107a à la surface de la cellule effectrice et peut donc être utilisée comme un marqueur de l'activité cytotoxique.

Ensemble, les signatures décrites ci-dessus peuvent être profilées pour examiner l'état d'activation des sous-ensembles de lymphocytes dans le microenvironnement de la tumeur. Le panel Cytokine/Cytotoxicity permet ces mesures en combinant l'immunophénotypage de la surface cellulaire à l'aide d'anticorps spécifiques des cellules T, NK et NKT avec la coloration intracellulaire pour les cytokines et l'expression de la granzyme B (tableau 1).

Tableau 1 : le panel Cytokine/Cytotoxicity™

Anticorps/coloration

Description

CD45

Marqueur des cellules hématopoïétiques

CD3

Marqueur pan-T

CD4

Marqueur des lymphocytes T CD4+

CD8

Marqueur des lymphocytes T CD8+

CD49b/CD335

Marqueur des cellules NK et lymphocytes T NK

IFNγ

Cytokine pro-inflammatoire

TNFα

Cytokine pro-inflammatoire

IL-2*

Activateur des lymphocytes T

Granzyme B

Marqueur de cytotoxicité

CD107a

Marqueur de dégranulation

Colorant de viabilité

Exclusion des cellules mortes

*IL-2 peut être remplacée par d'autres cytokines comme IL-4 et IL-17a

 

Analyse des cytokines et du granzyme B dans les cellules effectrices dérivées de la tumeur 4T1-luc après irradiation et thérapie anti-mCTLA-4

Cet ensemble de données qui utilise le modèle de carcinome mammaire murin 4T1-luc montre bien l'utilité du panel Cytokine/ Cytotoxicity pour mesurer les cytokines et le granzyme B. La figure 1 montre la stratégie de gating utilisée pour délimiter les sous-ensembles de lymphocytes T et de cellules NK. Comme pour tous nos panels de cytométrie en flux en oncologie préclinique, l'analyse commence par l'exclusion des cellules mortes et la délimitation ultérieure des cellules immunitaires CD45+ pour identifier les sous-ensembles immunitaires d'intérêt (données non présentées). Des profils représentatifs de l'expression de IFNγ, TNFα, IL-2 et de la granzyme B après stimulation par PMA/ionomycine sont présentés. 

Figure 1 : gating des cytokines pro-inflammatoires et de la granzyme B dans les sous-ensembles de lymphocytes par cytométrie en flux
Figure 1 : gating des cytokines pro-inflammatoires et de la granzyme B dans les sous-ensembles de lymphocytes par cytométrie en flux

Le microenvironnement de la tumeur 4T1-luc est hautement immunosuppresseur et se caractérise par la présence d'un important infiltrat de cellules myéloïdes suppressives granulocytaires (données non présentées). 4T1-luc est un modèle connu pour être résistant aux thérapies d'inhibition des points de contrôle. Toutefois, combiné à la radiothérapie, délivrée par la plate-forme de recherche pour la radiothérapie sur les petits animaux (SARRP, Xstrahl), l'anti-mCTLA-4 améliore l'inhibition de la croissance des tumeurs 4T1-luc (figure 2A, à gauche). L'inhibition de la croissance tumorale n'est probablement pas due à une augmentation du recrutement de cellules effectrices induite par le traitement, car la cytométrie en flux ne montre pas d'augmentation du nombre de cellules T ou NK dans la tumeur à la suite du traitement in vivo, quelles qu'en soient les conditions, par rapport au groupe témoin de l'isotype (figure 2A, à droite). Cependant, la stimulation ex vivo des cellules dérivées de tumeurs par PMA/ionomycine révèle que les cellules T CD8+ ont une capacité accrue de produire IFNγ. De plus, les cellules NK expriment des niveaux plus élevés de granzyme B par rapport aux témoins (figure 2B).  Ces données suggèrent qu'un traitement combiné avec des radiations et des anti-mCTLA-4 améliore l'état d'activation des cellules T CD8+ et NK. Ceci démontre l'intérêt d'inclure des marqueurs mécanistes dans les études où l'efficacité et l'immunophénotypage sont recherchés.

Figure 2 - Panel Cytokine-Cytotoxicity
Figure 2 : analyse de la réponse pro-inflammatoire dans les cellules effectrices dans le modèle 4T1-luc. Des souris BALB/c présentant des tumeurs établies de type 4T1-luc (n=6/groupe) ont reçu des doses d'anti-mCTLA-4 (clone 9D9), une irradiation focale (RAD ; SARRP, Xstrahl Inc.), une combinaison des deux ou des anticorps témoins isotypes. Les tumeurs ont été dissociées en suspensions monocellulaires (gentleMACS™, Miltenyi Biotec), et marquées avec des anticorps fluorescents avant l'acquisition des données. Pour l'analyse des cytokines et de la granzyme B, les cellules dérivées de tumeurs ont été stimulées ex vivo avec de la PMA/ionomycine pendant 5 heures en présence de bréfeldine A. Après incubation, les cellules ont été collectées et immunocolorées pour des cibles intracellulaires. Les données ont été acquises sur un cytomètre en flux Attune™ NxT (ThermoFisher Scientific), puis analysées à l'aide du logiciel Flowjo (BD).

 

Analyse de la dégranulation dans les cellules effectrices dérivées de tumeurs CT26 après une thérapie anti-mCTLA-4

CD107a s'exprime à la surface des cellules pendant la dégranulation et est un marqueur couramment utilisé pour mesurer les effets du traitement sur l'activité cytotoxique. Le panel Cytokine/Cytotoxicity™ a été utilisé pour étudier les effets de l'anti-mCTLA-4 sur la cytotoxicité des lymphocytes et la croissance tumorale dans le modèle murin de carcinome colorectal CT26. Les souris porteuses de tumeurs CT26 traitées avec des anti-mCTLA-4 répondent par une inhibition de la croissance tumorale de 74 % (figure 3A). Pour examiner la cytotoxicité, l'expression de CD107a et de granzyme B a été mesurée dans les cellules T CD8+, NK et NKT après stimulation ex vivo de cellules dérivées de tumeurs avec de la PMA/ionomycine. Les profils d'expression représentatifs sont illustrés par la figure 3B. L'analyse révèle que le traitement anti-mCTLA-4 déclenche une augmentation de l'expression de la CD107 dans les trois sous-ensembles par rapport aux animaux traités par témoins d'isotype. Ceci coïncide avec une diminution de l'expression des niveaux de granzyme B dans les cellules NK et NKT. Les données suggèrent que les réserves de granzyme B dans les cellules NK et NKT sont vidées pendant la dégranulation. Notez que l'expression de la granzyme B des cellules T CD8+ n'était pas différente entre les groupes, peut-être en raison d'un équilibre dans l'expression de novo de la granzyme B déclenchée par le traitement et du taux de dégranulation. Dans l'ensemble, ce phénotype correspond à une amélioration de la cytotoxicité induite par le traitement et à un potentiel d'activité de destruction directe des cellules tumorales.

Figure 3 - Panels Cytokine-Cytotoxicity
Figure 3 : analyse de la cytotoxicité dans le modèle CT26. Des souris BALB/c ayant des tumeurs CT26 établies (n=10/groupe) ont été traitées par anti-MPD-1 (clone RMP1-14) ou des anticorps témoins d'isotype. La stimulation ex vivo et l'immunophénotypage ont été effectués comme décrit ci-dessus.

 

Personnalisation - Configuration du panel pour personnaliser les réponses aux cytokines

Le panel Cytokine/Cytotoxicity™ est préconfiguré pour mesurer les cytokines pro-inflammatoires. Le panel peut aussi être personnalisé pour étudier d'autres réponses de cytokines. Par exemple, les cellules T CD4+ auxiliaires se différencient en différents phénotypes d'effecteurs CD4+, qui comprennent Th1, Th2 et Th17. Ces sous-ensembles ont des rôles différents dans la pathogenèse des tumeurs. Les cellules Th1 sont caractérisées par la libération de IFNγ, tandis que les cellules Th2 et Th17 peuvent être caractérisées par la production d'IL-4 et d'IL-17, respectivement. Le panel Cytokine/Cytotoxicity™ peut être personnalisé pour inclure l'IL-4 et l'IL-17A afin de faciliter l'analyse mécaniste des effets induits par le traitement sur la différenciation des lymphocytes T auxiliaires dans le microenvironnement de la tumeur.

Pour en savoir plus sur la façon dont le panel Cytokine/Cytotoxicity™ peut être intégré dans votre recherche préclinique en oncologie, contactez les scientifiques de Covance.

Veuillez noter que toute la prise en charge des animaux et l'utilisation de ceux-ci ont été effectuées conformément à la réglementation sur le bien-être des animaux dans un établissement accrédité par l'AAALAC, avec examen et approbation du protocole de l'IACUC.

 

1. Clynes, R. A. et Desjarlais, J. R. (2019). Redirected T cell cytotoxicity in cancer therapy. Annual Review of Medicine70, 437-450.

2. Miller, J. S. et Lanier, L. L. (2019). Natural killer cells in cancer immunotherapy. Annual Review of Cancer Biology3, 77-103.

3. Bae, E. A., Seo, H., Kim, I. K., Jeon, I. et Kang, C. Y. (2019). Roles of NKT cells in cancer immunotherapy. Archives of Pharmacal Research, 1-6.