Nouveautés concernant l'utilisation préclinique des hPBMC dans la modélisation en immuno-oncologie

AUTEUR :

Sheri Barnes, Ph.D.

DATE :

Juillet 2020


En février, nous avons présenté les données initiales de la plate-forme en développement de Covance sur les souris humanisées utilisant une greffe de cellules mononuclées du sang périphérique humain (hPBMC).

Nos données utilisant la souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ont permis d'identifier quatre donneurs de hPBMC présentant une fenêtre de traitement d'au moins 30 jours après l'injection de hPBMC, une greffe de cellules T cohérente et la croissance de deux modèles de xénogreffes humaines, MiaPaCa-2 (pancréas) et A549 (CPNPC), qui a été robuste chez les souris NSG greffées avec hPBMC.

Nous présentons maintenant les premières données d'efficacité démontrant l'utilisation de souris NSG portant des xénogreffes humaines de MiaPaCa-2 ou A549 greffées avec hPBMC après traitement au pembrolizumab (Keytruda®, anti-hPD-1).

Conception expérimentale

L'objectif de ces études était d'évaluer la réponse anti-tumorale du pembrolizumab contre les modèles de tumeurs MiaPaCa-2 ou A549 humaines après la greffe de PBMC humaines chez les souris NSG. Le recours aux animaux et leur bien-être sont conformes au Guide du bien-être et du recours aux animaux de laboratoire, dans un centre accrédité par l'AAALAC.

Les souris NSG (Laboratoires Jackson, Bar Harbor, Maine, États-Unis, souche 0005557) ont reç des PBMC humaines par voie intraveineuse à partir de trois donneurs sains et normaux différents (Hemacare, Los Angeles Californie, États-Unis) une fois les tumeurs établies (~105 à 118 mm3). Le traitement à base de pembrolizumab a commencé le jour suivant l'injection de PBMC humaines. La réponse au pembrolizumab, l'évaluation de l'apparition de la maladie du greffon contre l'hôte (GVH) ont été déterminées, et du sang entier a été prélevé à deux moments pour l'analyse par cytométrie en flux des marqueurs lymphocytaires humains afin de confirmer la greffe de cellules CD45+ du donneur, y compris les lymphocytes T CD4+ et CD8+.

Croissance des tumeurs témoins MiaPaCa-2 et A549 chez des souris greffées avec des PBMC humaines

Le temps de doublement des tumeurs MiaPaCa-2 chez les animaux témoins non traités était de ~7 jours, chez les animaux ayant reçu des PBMC humaines, il variait de ~5 à 7 jours dans chaque groupe de donneurs.

Les tumeurs ont augmenté uniformément pour atteindre un volume moyen de 1000-1200 mm3 le 36e jour chez les trois donneurs, mais une certaine variabilité intra et intergroupe a été observée au-delà du jour 36. La croissance de la tumeur avant d'atteindre 1000 mm3 ne semble pas avoir été influencée par la greffe de PMBC humaines (Figure 1).

Ces résultats suggèrent que l'utilisation de n'importe lequel de ces trois donneurs serait appropriée pour des études d'efficacité sur MiaPaCa-2 avec un délai d'évaluation (TES pour « Time to evaluation size ») de 1000 mm3.

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Figure 1. Croissance témoin des tumeurs MiaPaCa-2 sous-cutanées après administration des PBMC humaines

 

Le temps de doublement de la tumeur A549 chez les animaux témoins non traités était de ~11 jours, et il variait de 9 à 12 jours chez les animaux ayant reçu des PBMC humaines dans chaque groupe de donneurs.

Les tumeurs ont connu une croissance uniforme avec les PBMC humaines des donneurs 1 et 3 pour atteindre un volume tumoral moyen de 1000-1200 mm3 le jour 40 avec une certaine variabilité de la croissance au-delà du jour 40. 

La variabilité intragroupe était la plus évidente chez les souris porteuses de tumeurs A549 et de PBMC humaines du donneur 2 (figure 2). 

Ces résultats suggèrent que les donneurs 1 et 3 conviennent particulìeerment pour les études d'efficacité sur A549 avec un délai d'évaluation (TES) de 1000 mm3.

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Figure 2. Croissance témoin de tumeurs A549 sous-cutanées après administration de PBMC humaines

 

Greffe et persistance des lymphocytes humains

La greffe a été évaluée au jour 28 et soit au jour 38 (MiaPaCa-2) ou au jour 42 (A549) après administration de hPBMC par analyse immunophénotypique de marqueurs de cellules immunitaires humaines dans le sang périphérique des souris d'étude. 

Les marqueurs de cytométrie en flux comprennent mCD45, hCD45, hCD3, hCD4 et hCD8. Les cellules CD45+ humaines, en pourcentage de cellules vivantes d'animaux portant soit une tumeur MiaPaCa-2 (figure 3A) soit une tumeur A549 (figure 3B), sont présentées ci-dessous et ont été utilisées comme indicateur de la greffe de hPBMC. 

Nous avons détecté des cellules CD45+ humaines dans le sang total de tous les donneurs aux deux moments T, ce qui correspond aux résultats existants1.

Bien que la variabilité intragroupe soit évidente, la taille moyenne de la greffe est restée constante ou a augmenté entre le premier et le deuxième moment. Il ressort de l'expérience que les hPBMC greffées sur des animaux porteurs de tumeurs A549 étaient un peu plus élevées que celles greffées sur des animaux porteurs de tumeurs MiaPaCa-2, ce qui est cohérent avec nos données initiales de développement du modèle. 

À l'heure actuelle, on ignore si cela résulte d'une variabilité normale d'une étude à l'autre ou s'il existe une dépendance du modèle à la greffe.  

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Figure 3. Greffe de cellules CD45+ humaines détectées dans le sang total de souris NSG ayant reçu des PBMC humaines et des xénogreffes de MiaPaCa-2 (A) ou A549 (B).

 

La figure 4 illustre un exemple de distribution des lymphocytes T CD4+ et CD8+ dans le sang total et montre que la distribution des lymphocytes T était cohérente entre les points dans le temps. 

Ces données ne concernent que le donneur 1 chez les souris porteuses de tumeurs MiaPaCa-2, mais des données similaires ont été rapportées pour l'ensemble des donneurs et des modèles testés. 

Plus précisément, la distribution des lymphocytes T CD4+ et CD8+  ;a varié de 42 à 65 % et 32 à 46 % respectivement, chez les souris porteuses de MiaPaCa-2, et de 51 à 67 % et 22 à 44 % respectivement, chez les souris porteuses de A549 (données non présentées). 

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Figure 4. Greffe de lymphocytes T hCD4 + et hCD8+ (en pourcentage des cellules hCD45+) détectées dans le sang total des souris NSG porteuses d'une tumeur MiaPaCa-2-qui ont reçu des PBMC humaines du donneur 1.

 

L'apparition de symptômes de GVH a été surveillée via le poids corporel et des observations cliniques. Bien que non confirmés pathologiquement dans ces études, les symptômes observés dans ces modèles sont fortement corrélés avec la maladie2 et avec des données antérieures (données non présentées).

Réponse au pembrolizumab

Il est intéressant de noter que le traitement au pembrolizumab chez les souris greffées avec des PBMC humaines n'a eu d'incidence sur la croissance des tumeurs MiaPaCa-2 ou A549 chez aucun des donneurs dans les conditions testées (figures 5 et 6). 

Au moment de la rédaction de cet article, il existait très peu de travaux concernant la réponse in vivo au pembrolizumab chez les souris humanisées greffées par hPBMC et portant des tumeurs MiaPaCa-2. 

Néanmoins, nos données reflètent celles d'un large corpus concernant la nature réfractaire des tumeurs du pancréas aux agents immuno-oncologiques3. La réponse du pembrolizumab contre l'A549 semble modérée comme indiqué précédemment, et cette réponse semble dépendre du donneur 4.

Malgré l'absence constante de réponse du pembrolizumab contre l'A549 ou la MiaPaCa-2, ces modèles peuvent s'avérer utiles pour les approches thérapeutiques utilisant des stratégies d'association rationnelles avec anti-hPD-1 car il existe une marge d'amélioration importante et d'évaluation des réponses variables entre les différents donneurs.  

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Figure 5. Croissance tumorale des tumeurs MiaPaCa-2 sous-cutanées après administration de PBMC humaines et traitement avec un isotope témoin ou du pembrolizumab (anti-hPD-1)
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Figure 6. Croissance tumorale des tumeurs A549 sous-cutanées après administration de PBMC humaines et traitement avec un isotope témoin ou du pembrolizumab (anti-hPD-1)

 

L'administration de PBMC humaines à des souris NSG entraîne la persistance de lymphocytes T humains chez la souris avec des effets minimes sur la croissance des tumeurs MiaPaCa-2 ou A549. Cette approche représente une puissante plateforme préclinique pour examiner les effets de nouveaux agents humains qui exploitent les lymphocytes T humains pour diriger une activité anti-tumorale ayant une signification clinique directe.

Les recherches futures démontreront l'infiltration des lymphocytes T humains dans la tumeur et sa périphérie par cytométrie en flux avec le traitement des immunothérapies autorisées par la FDA contre les xénogreffes de tumeurs humaines chez les souris NSG, reconstituées avec des PBMC humaines.

Covance possède des réserves de ces donneurs de PBMC humaines dans ses banques de données, disponibles pour vos recherches.  Veuillez contacter nos scientifiques spécialistes de l'oncologie préclinique pour voir comment nos souris NSG greffées avec PBMC humaines peuvent servir dans votre prochaine étude en immuno-oncologie translationnelle.

Références :

1.Todd Pearson, Dale L. Greiner et Leonard D. Shultz. Creation of “Humanized” Mice to Study Human Immunity. 2008. Curr Protoc Immunol Chapitre 15 : Unité 15,21

2.Sina Naserian, Mathieu Leclerc, Allan Thiolat, Caroline Pilon, Cindy Le Bret, Yazid Belkacemi, Sébastien Maury, Frédéric Charlotte et José L. Cohen. Simple, Reproducible, and Efficient Clinical Grading System for Murine Models of Acute Graft-versus-Host Disease. 2018. Front. in Immun. (9): 10.

3.Robert J. Torphy, Yuwen Zhu et Richard D. Schulick. Immunotherapy for pancreatic cancer: Barriers and breakthroughs. 2018. Ann Gastroenterol Surg. 2(4): 274–281.

4.Shouheng Lin, Guohua Huang Lin Cheng, Zhen Li, Yiren Xiao,Qiuhua Deng,Yuchuan Jiang,Baiheng Li,Simiao Lin,Suna Wang,Qiting Wu,Huihui Yao,Su Cao,Yang Li,Pentao Liu, Wei Wei,Duanqing Pei,Yao Yao, Zhesheng Wen, Xuchao Zhang, Yilong Wu, Zhenfeng Zhang, Shuzhong Cui, Xiaofang Sun, Xueming Qian et Peng Li. Establishment of peripheral blood mononuclear cell-derived humanized lung cancer mouse models for studying efficacy of PD-L1/PD-1 targeted immunotherapy. 2018. MAbs. 10(8): 1301–1311.