Nouveautés concernant l'utilisation préclinique des hPBMC dans la modélisation en immuno-oncologie

Date : juillet 2020

Author: Sheri Barnes, Ph.D.

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In February, we presented initial data of Labcorp's emerging humanized mouse platform utilizing human peripheral blood mononuclear cell (hPBMC) engraftment.

Our data using the NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mouse resulted in identification of four hPBMC donors that exhibited a treatment window of at least 30 days post hPBMC injection, consistent T cell engraftment, and growth of two human xenograft models, MiaPaCa-2 (pancreatic) and A549 (NSCLC), that was robust in hPBMC-engrafted NSG mice.

Nous présentons maintenant les premières données d'efficacité démontrant l'utilisation de souris NSG portant des xénogreffes humaines de MiaPaCa-2 ou A549 greffées avec hPBMC après traitement au pembrolizumab (Keytruda®, anti-hPD-1).

Conception expérimentale

L'objectif de ces études était d'évaluer la réponse anti-tumorale du pembrolizumab contre les modèles de tumeurs MiaPaCa-2 ou A549 humaines après la greffe de PBMC humaines chez les souris NSG. Le recours aux animaux et leur bien-être sont conformes au Guide du bien-être et du recours aux animaux de laboratoire, dans un centre accrédité par l'AAALAC.

Les souris NSG (Laboratoires Jackson, Bar Harbor, Maine, États-Unis, souche 0005557) ont reçu des PBMC humaines par voie intraveineuse à partir de trois  donneurs sains et normaux différents (Hemacare, Los Angeles Californie, États-Unis) une fois les tumeurs établies (~105 à 118 mm3). Le traitement à base de pembrolizumab a commencé le jour suivant l'injection de PBMC humaines. Response to pembrolizumab, evaluation of onset of Graft vs. Host Disease (GvHD)-like characteristics were determined, and whole blood was collected at two timepoints for flow cytometry analysis of human lymphocyte markers to confirm donor engraftment of CD45+ cells, including CD4+ and CD8+ T cells.

Croissance des tumeurs témoins MiaPaCa-2 et A549 chez des souris greffées avec des PBMC humaines

Le temps de doublement des tumeurs MiaPaCa-2 chez les animaux témoins non traités était de ~7 jours, chez les animaux ayant reçu des PBMC humaines, il variait de ~5 à 7 jours dans chaque groupe de donneurs.

Les tumeurs ont augmenté uniformément pour atteindre un volume moyen de 1000-1200 mm3 le 36e jour chez les trois donneurs, mais une certaine variabilité intra et intergroupe a été observée au-delà du jour 36. La croissance de la tumeur avant d'atteindre 1000 mm3 ne semble pas avoir été influencée par la greffe de PMBC humaines (figure 1).

Ces résultats suggèrent que l'utilisation de n'importe lequel de ces trois donneurs serait appropriée pour des études d'efficacité sur MiaPaCa-2 avec un délai d'évaluation (TES pour « Time to evaluation size ») de 1000 mm3.

Figure 1. Croissance témoin des tumeurs MiaPaCa-2 sous-cutanées après administration des PBMC humaines

Figure 1. Croissance témoin des tumeurs MiaPaCa-2 sous-cutanées après administration des PBMC humaines

Le temps de doublement de la tumeur A549 chez les animaux témoins non traités était de ~11 jours, et il variait de 9 à 12 jours chez les animaux ayant reçu des PBMC humaines dans chaque groupe de donneurs.

Les tumeurs ont connu une croissance uniforme avec les PBMC humaines des donneurs 1 et 3 pour atteindre un volume tumoral moyen de 1000-1200 mm3 le jour 40 avec une certaine variabilité de la croissance au-delà du jour 40.

La variabilité intragroupe était la plus évidente chez les souris porteuses de tumeurs A549 et de PBMC humaines du donneur 2 (figure 2).

These results suggest that donors 1 and 3 are most suitable for A549 efficacy studies with a TES of 1000mm3.

Figure 2. Croissance témoin de tumeurs A549 sous-cutanées après administration de PBMC humaines

Figure 2. Croissance témoin de tumeurs A549 sous-cutanées après administration de PBMC humaines

Greffe et persistance des lymphocytes humains

La greffe a été évaluée au jour 28 et soit au jour 38 (MiaPaCa-2) ou au jour 42 (A549) après administration de hPBMC par analyse immunophénotypique de marqueurs de cellules immunitaires humaines dans le sang périphérique des souris d'étude.

Les marqueurs de cytométrie en flux comprennent mCD45, hCD45, hCD3, hCD4 et hCD8. Human CD45+ cells, as a percentage of live cells from animals harboring either MiaPaCa-2 (Figure 3A) or A549 tumors (Figure 3B), are presented below and were used as an indicator of hPBMC engraftment.

We found that hCD45+ cells in whole blood were detected across all donors at both timepoints and were in line with published literature.1

Bien que la variabilité intragroupe soit évidente, la taille moyenne de la greffe est restée constante ou a augmenté entre le premier et le deuxième moment. Il ressort de l'expérience que les hPBMC greffées sur des animaux porteurs de tumeurs A549 étaient un peu plus élevées que celles greffées sur des animaux porteurs de tumeurs MiaPaCa-2, ce qui est cohérent avec nos données initiales de développement du modèle.

À l'heure actuelle, on ignore si cela résulte d'une variabilité normale d'une étude à l'autre ou s'il existe une dépendance du modèle à la greffe.

Figure 3. Greffe de cellules CD45+ humaines détectées dans le sang total de souris NSG ayant reçu des PBMC humaines et des xénogreffes de MiaPaCa-2 (A) ou A549 (B).

Figure 3. Greffe de cellules CD45+ humaines détectées dans le sang total de souris NSG ayant reçu des PBMC humaines et des xénogreffes de MiaPaCa-2 (A) ou A549 (B).

Figure 4 illustrates an example of distribution of CD4+ and CD8+ T cells in whole blood and illustrates that the distribution of T cells was consistent between timepoints. 

Ces données ne concernent que le donneur 1 chez les souris porteuses de tumeurs MiaPaCa-2, mais des données similaires ont été rapportées pour l'ensemble des donneurs et des modèles testés.

Specifically, distribution of CD4+ and CD8+ T cells ranged from 42-65 % and 32-46 %, respectively, in MiaPaCa-2-bearing mice, and 51-67 % and 22-44 %, respectively, in A549-bearing mice (data not shown). 

Figure 4. Greffe de lymphocytes T hCD4 + et hCD8+ (en pourcentage des cellules hCD45+) détectées dans le sang total des souris NSG porteuses d'une tumeur MiaPaCa-2-qui ont reçu des PBMC humaines du donneur 1.
Figure 4. Engraftment of hCD4 + and hCD8+ T cells (as a % of hCD45+ cells) detected in whole blood from MiaPaCa-2-bearing NSG mice administered hPBMCs from Donor 1

Onset of GvHD symptoms was monitored by body weight and clinical observations; though not confirmed pathologically in these studies, symptoms observed in these models are strongly correlated with the disease2 and with previous data (data not shown).

Réponse au pembrolizumab

Il est intéressant de noter que le traitement au pembrolizumab chez les souris greffées avec des PBMC humaines n'a eu d'incidence sur la croissance des tumeurs MiaPaCa-2 ou A549 chez aucun des donneurs dans les conditions testées (figures 5 et 6).

Au moment de la rédaction de cet article, il existait très peu de travaux concernant la réponse in vivo au pembrolizumab chez les souris humanisées greffées par hPBMC et portant des tumeurs MiaPaCa-2.

Notwithstanding, our data is reflective of a wide literature regarding the refractory nature of pancreatic tumors to immuno-oncology agents.3  Response of pembrolizumab against A549 appears moderate as reported previously, and that response seems to be donor dependent.4

Malgré l'absence constante de réponse du pembrolizumab contre l'A549 ou la MiaPaCa-2, ces modèles peuvent s'avérer utiles pour les approches thérapeutiques utilisant des stratégies d'association rationnelles avec anti-hPD-1 car il existe une marge d'amélioration importante et d'évaluation des réponses variables entre les différents donneurs.

Figure 5. Croissance tumorale des tumeurs MiaPaCa-2 sous-cutanées après administration de PBMC humaines et traitement avec un isotope témoin ou du pembrolizumab (anti-hPD-1)

Figure 5. Croissance tumorale des tumeurs MiaPaCa-2 sous-cutanées après administration de PBMC humaines et traitement avec un isotope témoin ou du pembrolizumab (anti-hPD-1)

Figure 6. Croissance tumorale des tumeurs A549 sous-cutanées après administration de PBMC humaines et traitement avec un isotope témoin ou du pembrolizumab (anti-hPD-1)

Figure 6. Croissance tumorale des tumeurs A549 sous-cutanées après administration de PBMC humaines et traitement avec un isotope témoin ou du pembrolizumab (anti-hPD-1)

L'administration de PBMC humaines à des souris NSG entraîne la persistance de lymphocytes T humains chez la souris avec des effets minimes sur la croissance des tumeurs MiaPaCa-2 ou A549. Cette approche représente une puissante plateforme préclinique pour examiner les effets de nouveaux agents humains qui exploitent les lymphocytes T humains pour diriger une activité anti-tumorale ayant une signification clinique directe.

Les recherches futures démontreront l'infiltration des lymphocytes T humains dans la tumeur et sa périphérie par cytométrie en flux avec le traitement des immunothérapies autorisées par la FDA contre les xénogreffes de tumeurs humaines chez les souris NSG, reconstituées avec des PBMC humaines.

Labcorp has banked supplies of these human PBMC donors to be available for your research needs. Please contact our preclinical oncology scientists to see how hPBMC-engrafted NSG mice can be used for your next translational immuno-oncology study.

Références


1.Todd Pearson, Dale L. Greiner et Leonard D. Shultz. Creation of “Humanized” Mice to Study Human Immunity. 2008. Curr Protoc Immunol Chapitre 15 : Unité 15,21

 

2.Sina Naserian, Mathieu Leclerc, Allan Thiolat, Caroline Pilon, Cindy Le Bret, Yazid Belkacemi, Sébastien Maury, Frédéric Charlotte et José L. Cohen. Simple, Reproducible, and Efficient Clinical Grading System for Murine Models of Acute Graft-versus-Host Disease. 2018. Front. in Immun. (9): 10.

 

3.Robert J. Torphy, Yuwen Zhu et Richard D. Schulick. Immunotherapy for pancreatic cancer: Barriers and breakthroughs. 2018. Ann Gastroenterol Surg. 2(4): 274–281.

 

4.Shouheng Lin, Guohua Huang Lin Cheng, Zhen Li, Yiren Xiao,Qiuhua Deng,Yuchuan Jiang,Baiheng Li,Simiao Lin,Suna Wang,Qiting Wu,Huihui Yao,Su Cao,Yang Li,Pentao Liu, Wei Wei,Duanqing Pei,Yao Yao, Zhesheng Wen, Xuchao Zhang, Yilong Wu, Zhenfeng Zhang, Shuzhong Cui, Xiaofang Sun, Xueming Qian et Peng Li. Establishment of peripheral blood mononuclear cell-derived humanized lung cancer mouse models for studying efficacy of PD-L1/PD-1 targeted immunotherapy. 2018. MAbs. 10(8): 1301–1311.
 
Remarque : Veuillez noter que toute la prise en charge des animaux et l'utilisation de ceux-ci ont été effectuées conformément à la réglementation sur le bien-être des animaux dans un établissement accrédité par l'AAALAC, avec examen et approbation du protocole de l'IACUC.

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