Essais cliniques oncologiques 

La cytométrie en flux phospho-flow pour le dépistage des événements de signalisation intracellulaire dans les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires

La recherche préclinique sur le développement d'inhibiteurs de petites molécules qui bloquent l'activité des kinases associés à la maladie demeure un aspect très important de la thérapie contre le cancer. Par conséquent, ces plateformes solides qui peuvent quantifier l'état de phosphorylation de ces kinases sont très importantes dans le développement de médicaments. À l'aide du modèle de leucémie aiguë myéloïde (LAM) MV-4-11, ces nouvelles informations décrivent de nouveaux services de phospho-flux in vitro et ex vivo proposés par Covance qui mesurent la signalisation phosphokinase de manière cohérente et facile à reproduire. Cette plateforme utilise des anticorps marqués par fluorescence qui reconnaissent les protéines uniquement lorsqu'elles sont phosphorylés sur des résidus d'acides aminés spécifiques qui régulent leur fonction. De plus, nous démontrons la manière dont le phospho-flux peut intégrer un immunophénotypage à haut débit avec détection de phospho-protéine, ce qui représente un certain avantage par rapport aux techniques ELISA et autres techniques conventionnelles.

Le passage entre l'homéostasie et l'apparition du cancer est contrôlé par un réseau complexe de systèmes de signalisation intracellulaire qui régulent l'expression des gènes. Ces voies moléculaires sont composées d'une cascade de protéines de signalisation qui assurent un large éventail de fonctions biologiques. Elles comprennent, entre autres, la régulation du cycle cellulaire, l'apoptose, la survie des cellules, l'angiogenèse, la migration des cellules et la réponse immunitaire. Le dérèglement de l'une de ces voies a le potentiel de favoriser la pathogenèse du cancer en bloquant la capacité de l'hôte à contrôler la prolifération cellulaire et la croissance de la tumeur et/ou la maladie métastatique qui en résulte.1,2,3

Le schéma de la figure 1 illustre comment l'activation constitutive de la voie phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protéine kinase B (AKT)/cible mammalienne de la rapamycine (mTOR) peut favoriser la croissance des tumeurs. L'activation de cette voie et d'autres voies est largement contrôlée par les protéines kinases, qui sont des enzymes qui activent les protéines en aval en ajoutant un groupe phosphate aux résidus de sérine, de thréonine ou de tyrosine. L'état de phosphorylation de ces protéines est souvent utilisé comme lecture pour l'activation de la signalisation. Inversement, la signalisation cellulaire peut être interrompue par les protéines phosphatases qui éliminent ces groupes de phosphate.

Pour démontrer comment le phospho-flow peut être utilisé pour mesurer les changements dans la phosphorylation des protéines, des cellules MV-4-11 ont été traitées in vitro avec l'inhibiteur pan-AKT développé par Merck & Co, MK-2206 (Selleckchem ; Houston, TX). La figure 2 montre que le MK-2206 provoque la déphosphorylation de l'AKT et de la S6 dans les cellules MV-4-11 après deux et 24 heures de traitement. Le traitement par MK-2206 provoque également l'apoptose, qui a été mesurée par l'activation de la caspase-3 et la liaison à l'annexine V (figure 3).

Le traitement par MK-2206 réduit la phosphorylation de AKT et S6 dans les cultures de cellules MV-4-11

Fig. [#0]} : le traitement par MK-2206 diminue les niveaux de phosphorylation de l'AKT et de la S6 dans les cellules MV-4-11. Les cellules MV-4-11 ont été implantées dans des plaques de culture et traitées avec 10 µM de MK-2206 ou laissées sans traitement. Les niveaux de p-AKT et de p-S6 ont été mesurés par phospho-flow. L'intensité médiane de fluorescence (IMF) est présentée sous forme d'histogrammes et de graphiques à barres. Les histogrammes rouge et bleu représentent respectivement les cultures traitées et non traitées par MK-2206. Chaque condition expérimentale a été réalisée en double. Les données présentées sont issues de trois expériences.

Le MK-2206 provoque l'apoptose des cellules MV-4-11.

Pour démontrer que le phospho-flow peut produire des résultats similaires aux techniques conventionnelles, une analyse par Western Blot a été réalisée, qui a révélé un schéma similaire de déphosphorylation de l'AKT et de la S6 après traitement par MK-2206 (figure 4).

Fig. [#0]} : l'analyse par Western blot a donné des résultats conformes à l'analyse par phospho-flow. Les cellules MV-4-11 ont été traitées avec 10µM de MK-2206 ou laissées sans traitement pendant 24 heures. Des extraits de protéines totales ont été transférés sur des membranes en PVDF et sondés avec des anticorps anti-p-AKT (Ser473) et anti-p-S6 (Ser240/244) pour mesurer les niveaux de phosphorylation. La densitométrie a révélé que le traitement par MK-2206 réduisait les signaux p-AKT et p-S6 de 13,2 % et 34,1 % respectivement. La présence de l'α-tubuline a été sondée comme contrôle de charge.

Pour démontrer comment le phospho-flow peut être utilisé en association avec l'immunophénotypage, des souris porteuses de cellules tumorales MV-4-11 disséminées ont reçu une dose de MK-2206 ou de vecteur de contrôle, tandis que la phosphorylation de l'AKT et de la S6 a été mesurée ex vivo par phospho-flow. La figure 5 montre que le traitement in vivo par MK-2206 provoque la déphosphorylation de l'AKT et de la S6 dans les cellules tumorales MV-4-11 de la moelle osseuse, mais seulement de l'AKT dans les lymphocytes de souris.

L'effet du traitement MK-2206 in vivo sur AKT et la phosphorylation de S6 diffèrent dans la tumeur et les cellules hôtes

Fig. [#0]} : le traitement in vivo par MK-2206 réduit les niveaux de p-AKT et de p-S6 dans les cellules tumorales MV-4-11 détectées dans la moelle osseuse par cytométrie en flux. Des souris portant des tumeurs MV-4-11 disséminées ont reçu deux doses de MK-2206 (180 mg/kg) ou de vecteur (N=5 souris/groupe) au 17e et 18e jour suivant l'implantation. Au 19e jour, de la moelle osseuse a été prélevée sur les fémurs et les tibias pour être analysée. L'immunophénotypage a été utilisé pour distinguer les cellules tumorales MV-4-11 ( partie supérieure) des lymphocytes de souris (partie inférieure) en marquant les échantillons avec des anticorps anti-CD45 humains et anti-CD45 de souris respectivement. Les données sont présentées sous la forme d'une moyenne calculée sur la base approximative de l'écart-type.  L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du test t de Student.

Les résultats ci-dessus démontrent que le phospho-flow présente une utilité polyvalente. C'est un outil précieux pour l'étude de nouveaux médicaments et de leurs effets sur l'activation des voies de signalisation cellulaire in vitro. La technique phospho-flow permet également de mesurer les effets des médicaments in vivo en multiplexant la technique avec des marqueurs de surface cellulaire utilisés pour l'immunophénotypage pour distinguer l'analyse dans différents sous-ensembles cellulaires.

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1Marmiroli, Sandra, et al. “Phosphorylation, signaling, and cancer: targets and targeting.” BioMed Research International 2015 (2015).

2Bianco, Roberto, et al. “Key cancer cell signal transduction pathways as therapeutic targets.” European Journal of Cancer 42,3 (2006): 290-294.

3Nitulescu, George Mihai, et al. “Akt inhibitors in cancer treatment: The long journey from drug discovery to clinical use (Review).” International Journal of Oncology 48,3 (2016): 869-885.

4Min, Y. H., et al. “Constitutive phosphorylation of Akt/PKB protein in acute myeloid leukemia: its significance as a prognostic variable.” Leukemia 17,5 (2003): 995-995.

5Lu, Jeng-Wei, et al. “MK-2206 induces apoptosis of AML cells and enhances the cytotoxicity of cytarabine.” Medical Oncology 32,7 (2015): 1-9.

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