Comprendre le pouvoir des cellules NK et des nouvelles approches de dosage non radioactif

Les cellules NK ont gagné leur réputation de cellules « tueuses » il y a près de 40 ans, lorsque les chercheurs ont observé la rapidité de la réponse immunitaire de ces lymphocytes, au moment de détruire les cellules hôtes infectées par un virus où les cellules tumorales. Les cellules NK semblaient capables de s'attacher spontanément, sans activation préalable. Au fil du temps, les chercheurs ont fait plus de découvertes sur les mécanismes moléculaires qui régulent leurs activations et fonctions.

Actuellement, on utilise le dosage des cellules NK dans le cadre des études d'immunotoxicologie de spécialité, pour l'évaluation de la sécurité. Chez Covance, nous travaillons avec des clients qui nous demandent souvent de réaliser une analyse fonctionnelle des cellules NK et qui nous parlent du rôle de l'immunophénotypage classique dans le comptage des cellules. Cet article se penche sur ces questions en offrant un bref aperçu du contexte de l'immunité innée de la biologie des cellules NK et en comparant les méthodes de dosage.

Un équilibre entre immunité innée et adaptative

Les lymphocytes T et B jouent un rôle essentiel dans l'immunité adaptative. Avec une réponse immunitaire lente (4-7 jours), elles jouent un rôle très spécifique car chaque cellule reconnaît un seul antigène, ce qui induit une mémoire immunologique à long terme. L'immunité adaptative est très observée en tant que système intelligent, multiple, évolué et réactif en protégeant l'hôte lorsque le schéma basique d'identification ne suffit pas.

Figure 1. Aperçu du dosage de cellules NK.

Les cellules faisant partie de la catégorie d'immunité innée sont plus rapides et non-spécifiques et chaque cellule agit temporairement avec de nombreux pathogènes. L'immunité innée peut permettre de contrôler les infections pendant que la réponse immunitaire adaptative initiale se développe. Par exemple, les neutrophiles sont généralement les premiers à attaquer en détruisant une bactérie ou un virus ou une autre entité pouvant provoquer une maladie. Les macrophages récupèrent alors les pièces rompues et les présentent au système immunitaire adaptatif.

Ensemble, les systèmes inné et adaptatif doivent préserver l'homéostasie, un élément important de l'équilibre immunitaire.

La fonction essentielle d'une cellule NK

Les cellules immunitaires détectent communément le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHC-I) présenté à la surface des cellules infectées, ce qui déclenche la production de cytokine et provoque une lyse cellulaire ou apoptose (mort cellulaire programmée). Les cellules malignes échappant aux marqueurs MHC-I ne peuvent pas être détectées et détruites par les autres cellules immunitaires, comme les lymphocytes de type T.

Les cellules NK ont la capacité de reconnaître les cellules stressées en l'absence d'anticorps et de MHC-I, ce qui permet une réaction immunitaire beaucoup plus rapide, et elles servent de défense vitale contre les infections virales et les cellules cancéreuses.

Comparer les dosages spécifiques au stade immunitaire

Le dosage de l'activité de la cellule NK est décrit dans les directives de l'ICH Études d'immunotoxicité S8 pour les produits pharmaceutiques humains, mais cette directive peut être jugée trop vague. Les promoteurs demandent souvent à nos experts Covance de définir des étapes plus prescriptives. À haut niveau, les cellules effectrices contiennent des cellules NK et l'expression du MCH-I n'atteint pas les cellules cibles. Une culture commune de cellules effectrices et cibles à différents ratios peut permettre de mesurer la mort cellulaire ciblée.

Plusieurs dosages d'activité de cellules NK sont disponibles, chacune ayant sa propre méthode d'évaluation. Le dosage de libération à haut rendement au chrome-51 (51Cr) a été utilisé depuis plus de 40 ans et il est désormais considéré comme incontournable. Les cellules cibles avec une faible expression CMH-1 dans le dosage sont étiquetées avec du chrome radioactif. Quand la cible est attaquée par les cellules NK et détruite, elle libère une dose spontanée de 51Cr, qui peut être mesurée pour déterminer la fonction de la cellule NK.

Cependant, les exigences autour de la production de matériau radioactif, sa manipulation et le traitement de ses déchets ont conduit à une chute du 51Cr au profit de certains dosages alternatifs. La directive ICH S8 reconnaît ce changement et mentionne que « de nouvelles méthodes utilisant des étiquetages non-radioactifs peuvent être utilisées à condition d'être validées. » Ces nouvelles méthodes prévoient :

Un dosage colorimétrique sur plaque : comme pour le dosage de libération de 51Cr, le dosage colorimétrique sur plaque utilise une enzyme dans la cellule cible qui provoque une mutation enzymatique dans la densité optique des puits lorsque les cellules sont détruites et l'enzyme libérée. Cette mutation peut être capturée pour mesurer l'effet des cellules NK. Bien qu'il s'agisse d'une méthode à haut rendement, elle ne peut pas distinguer la mort cellulaire cible de la mort des cellules effectrices.

Dosage sur plaques par fluorescence : comme la méthode sur plaque, les dosages par fluorescence effectuent les mesures en utilisant une plaque fluorescente et présentent aussi un haut rendement. Néanmoins, lors de nos validations en interne, nous avons décelé des limites avec un étiquetage inconsistant des cellules cibles avec calcéine-AM (acetoxymethyl) et libération spontanée de calcéine-AM.

Cytométrie en flux : cette méthode peut énumérer individuellement les cellules cibles et les cellules effectrices. La cytométrie en flux nous aide à évaluer la mort cellulaire pour chaque cellule, contrôler la viabilité des cellules, et nous permet d'ajouter des points d'étude intéressants à une étude. Bien que cette méthode ne soit pas considérée comme une méthode à haut rendement, Covance a compensé cette limitation en lançant un dosage sur plaque et en le transférant dans nos cytomètres pour mesurer la mort cellulaire cible.

Lancer un dosage d'activité cellulaire NK n'est pas un processus direct, notamment en cas d'évaluation à plusieurs niveaux. Néanmoins, avec une planification proactive et des processus validés, l'analyse fonctionnelle des cellules NK ouvre la porte à une série de points de contrôle de l'immunotoxicité, de la découverte au développement, jusqu'au stade clinique.

Aric M. Frantz DVM, PhD

Le docteur Frantz est directeur scientifique du site pour l'immunotoxicité au sein du site de Covance basé à Madison. Il occupe les fonctions de scientifique ou d'investigateur principal en tant qu'immunotoxicologue et il est chargé d'interpréter et d'émettre les rapports d'immunotoxicologie. Le docteur Frantz a la responsabilité de prendre en charge tous les aspects techniques des études de toxicologie, en termes d'interprétation, d'analyse, de documentation et d'émission des rapports de résultats. Il a plus de 15 ans d'expérience dans la recherche universitaire et a reçu le Dr. Alvin Webber DVM/PhD Scholarship Award 2013 et le Doctoral Dissertation Fellowship 2011 de l'Université du Minnesota. Avant de rejoindre Covance, tout en occupant des fonctions au sein de la Comparative Pathology Core Facility de l'Université du Minnesota, le docteur Frantz a développé des techniques d'immunochimie, de colorations et de préparations novatrices ainsi qu'un système électronique pour suivre les clients, les cas d'étude et le statut des projets. Il a obtenu son PhD en biosciences comparatives et moléculaires, ainsi qu'un DVM au sein de l'Université du Minnesota.

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