5 types différents de dosages de libération de cytokines : affronter la tempête | Publication sur les DLC II

Dans notre article précédent, nous avons détaillé les dangers du syndrome de libération de cytokines (SLC) et l'importance des dosages précliniques de libération des cytokines (DLC) lors du développement d'anticorps monoclonaux (mAb) qui interagissent avec le système immunitaire du patient. Dans ce second article, nous décrivons les différents types de dosage utilisés et comment ils peuvent s'inscrire dans votre programme de développement de médicament. Un autre type de DLC, par co-culture de cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC pour « peripheral blood mononuclear cell ») et de cellules endothéliales (BOEC pour « blood outgrowth endothelial cell ») sera étudié plus en détail dans notre prochain article.

Voici quelques-unes des questions à vous poser au moment de choisir le DLC le plus approprié :

  • Le composé a-t-il une région Fc qui peut se lier aux récepteurs Fc-gamma néonatals des cellules endothéliales ?
  • La molécule se lie-t-elle à plus d'une cible ?
  • Expression de la cible chez les sujets sains ?
  • Quelles cytokines mesurer, étant donné que seules certaines cytokines sont en cause lors d'un choc cytokinique ?

Dosages du sang total

Les dosages du sang total sont l'un des DLC les plus utilisés. Leur principal avantage est qu'ils reproduisent de près les conditions in vivo. Le format du dosage recrée les fréquences des sous-ensembles de cellules immunitaires, la distribution cellulaire des récepteurs Fc-gamma et les niveaux d'expression aux niveaux physiologiques, révélant les liens entre le génotype FcγR et l'ampleur de la libération de cytokines en réponse au traitement par mAb.

Le DLC en sang total est beaucoup plus sensible que le DLC en phase solide PBMC (voir ci-dessous) pour l'alemtuzumab (anticorps anti-CD52) qui stimule la libération de cytokines par l'intermédiaire des récepteurs Fc-gamma. Cependant, les DLC en sang total ne sont pas sensibles à la libération de cytokines du muromonab-CD3 et du TGN1412 (superagoniste anti-CD28). D'autres études ont montré qu'une méthode de dosage du sang total est préférable aux PBMC pour la détection de la libération de cytokines par les oligonucléotides qui se lient aux récepteurs TLR.

PBMC humaines

Les PBMC se composent uniquement de lymphocytes (cellules T, B et NK) et de monocytes isolés. Elles sont extraites du sang total, donc le dosage est moins pertinent sur le plan physiologique que les DLC en sang total, mais il peut être plus sensible et révéler un signe cytokinique.

Il a été montré que le DLC en phase solide, qui implique la co-incubation des PBMC avec des mAb qui ont été déposés à sec sur une plaque de culture tissulaire, est prédictif du potentiel de libération de cytokines du TGN1412. Dans la phase liquide, les dosages en PBMC ne provoquent pas de réticulation de la cible ou de liaison Fc. Parmi les autres évaluations en phase solide, on peut citer l'application d'anticorps monoclonaux par voie humide sur le plastique du puits de culture tissulaire à une densité inférieure à celle présentée par l'application d'un revêtement sec. Toutes les techniques ci-dessus sont utilisées pour imiter la présentation physiologique des anticorps monoclonaux, mais restent différentes de la présentation in vivo, avec des inconvénients malencontreux en ce qui concerne le taux de faux positifs et le niveau de fond élevés lors du dosage. Les présentations en couche sèche ou humide s'appliquent aussi au dosage en sang total.   

DLC à haute densité

D'abord décrite par Romer et al dans pre-culturing PBMC cells at high density (2011), la pré-culture de cellules PBMC à haute densité améliore la sensibilité de l'essai pour détecter l'activation thérapeutique des cellules T. Les PMBC à haute densité répondent comme des cellules ressemblant à des ganglions lymphatiques par rapport aux PBMC à basse densité ordinaires.  Ce dosage ne provoque pas de réticulation de la cible ou de liaison Fc. Mais, contrairement aux dosages PBMC classiques, ce système peut être utilisé pour détecter les réponses positives au TGN1412 dans une phase soluble/liquide car les cellules sont dans un état « préparé » de type ganglion lymphatique.  

Co-culture des PBMC et des cellules endothéliales des veines ombilicales humaines (HUVEC)

Ce dosage provoque une réticulation de la cible et une liaison Fc. Les cellules endothéliales sont souvent cultivées à partir des veines ombilicales, qui servent d'interface avec les PBMC pour les tests de libération de cytokines. Comme ces essais sont constitués d'un mélange hétérologue de cellules, cela pourrait entraîner une inadéquation tissulaire – lorsque les cellules d'un donneur sont mélangées à celles d'un autre donneur – et cela pourrait être responsable de certaines limites des essais de co-culture HUVEC/PBMC.

Coculture des PMBC et des cellules endothéliales (BOEC)

Ce dosage autologue provoque une réticulation de la cible et une liaison Fc.  Décrit pour la première fois par Mitchelle et al. en 2015, ce format de dosage est similaire en concept au dosage HUVEC avec une légère différence. Les BOEC sont des cellules endothéliales cultivées à partir des PBMC prélevées chez un même donneur. Ce dosage étant totalement autologue, il n'y a pas de problème de mélange de tissus, ce qui améliore la sensibilité du dosage. Ce système de dosage est à ce jour le système in vitro, qui réplique le mieux le microenvironnement vasculaire in vivo. L'un des principaux avantages de ce système de dosage par rapport à d'autres formats est que le médicament thérapeutique biologique est présenté d'une manière plus pertinente sur le plan physiologique, comme s'il était administré par voie posologique. Ce dosage est un système breveté et Covance est actuellement le seul CRO à le proposer à ses clients.

Plan d'étude typique

Étant donné que les niveaux absolus des cytokines produites varient en fonction du dosage du DLC utilisé, il peut être difficile d'identifier un résultat vraiment positif. Par conséquent, les études sur la libération de cytokines devraient inclure des témoins positifs et négatifs pertinents. Le choix des anticorps monoclonaux témoins dépend du mécanisme d'action du produit évalué, p. ex. muromonab-CD3 ou TGN1412 pour les produits ciblant les cellules T ; alemtuzumab et/ou rituximab pour les produits à fonction effectrice cytotoxique ou phytohemaggluttin pour un contrôle mitogène positif.

L'étude devrait également utiliser des produits sanguins provenant de donneurs multiples (un minimum de 10 est conseillé) pour permettre un mélange physiologique naturel des échantillons. Si la cible n'est pas présente dans les échantillons de donneurs sains, il est suggéré de mener des études hybrides avec des donneurs sains et des échantillons provenant de patients. Les suggestions pour le choix de la posologie de la molécule devraient être choisies en fonction de l'occupation des récepteurs cibles et, au minimum, des doses élevées, moyennes et faibles devraient être envisagées.   

Défis présentés par les formats de dosages actuels

Ce ne sont pas toutes les plateformes de DLC qui peuvent faire la distinction entre les anticorps monoclonaux induisant une libération légère ou modérée de cytokines, pas plus qu'elles ne peuvent être utilisées pour déterminer un seuil où les concentrations de cytokines libérées peuvent être associées à des événements indésirables graves chez les humains. Les DLC ne sont pas encore entièrement prédictifs de la libération de cytokines, et leur précision dépend des types d'anticorps évalués. Pour cette raison, les chercheurs continuent de chercher des formats améliorés de DLC.

En savoir plus sur comment Covance peut vous aider dans votre parcours préclinique.

Vous n'avez pas encore lu le premier article de notre série ? Pour lire l'article d'introduction sur les dosages in vitro de libération de cytokines, suivez ce lien.

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