Induction enzymatique

Études recommandées par la FDA et l'EMA

Dosages de cytotoxicité et de stabilité

Induction d'ARNm CYP et d'enzymes

Lorsque vous étudiez les qualités métaboliques de votre médicament, il peut être judicieux d'inclure également des études d'induction enzymatique pour mettre en évidence les problèmes potentiels liés à l'obtention de concentrations plasmatiques efficaces des médicaments administrés en concomitance lorsque votre médicament induit ou augmente une expression enzymatique. L'induction enzymatique peut entraîner une augmentation de la clairance métabolique ou de la toxicité qui est causée par une exposition systémique accrue des métabolites actifs.

L'induction d'enzymes CYP (en général CYP1A2, CYP2B6 et CYP3A4) est mesurée in vitro après exposition à l'article testé dans des cultures monocouches d'hépatocytes humaines.

Les premières expériences devraient étudier la possibilité d'induire les enzymes CYP1A2, CYP2B6 et CYP3A4. Si une induction des enzymes CYP3A4 est observée, le promoteur doit également évaluer le potentiel d'induction des enzymes CYP2C (CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19). Les effets sont ensuite comparés à ceux provoqués par des inducteurs témoins positifs des enzymes CYP étudiées. En outre, des foies d'animaux ex vivo (généralement la souris, le rat, le chien ou le singe) peuvent être transformés en fractions subcellulaires et utilisés pour évaluer les effets induits par l'article testé sur les enzymes métabolisant le médicament après administration in vivo pendant les études d'évaluation de la sécurité.

Considérations réglementaires pour les études d'induction des enzymes

Ces études sont recommandées par les consignes de la FDA et de l'EMA sur les interactions médicamenteuses (IM) pour évaluer l'induction du cytochrome P450 pour le CYP1A2, CYP2B6,CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 et CYP3A4 avant de passer aux premiers essais chez l'homme.

Les données sur l'induction servent à déterminer les exigences et la portée des études cliniques des IM.

Méthode

Système de test : hépatocytes de donneurs humains individuels, cryopréservés
Enzymes CYP évaluées : CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4/5.
Tester les concentrations de l'article : choisies pour délimiter des expositions cliniques prévues (0,1 - 10X C_max), sauf si elles sont limitées par la solubilité. Sélectionner 5 concentrations pour la cytotoxicité, 7 pour l'induction de l'ARNm et 3 pour l'induction de l'activité enzymatique
Temps d'incubation : 72 heures, avec un renouvellement du milieu toutes les 24 heures.

Cytotoxicité

Dans les essais préliminaires, les hépatocytes d'un donneur sont cultivés en présence de l'article testé (cinq concentrations) ou du tamoxifène témoin positif (50 µM) dans des puits triples pendant 72 heures dans un incubateur humidifié à 37 °C dans 5 % de CO2, avec des échanges de milieu ± article testé ou témoins se produisant toutes les 24 heures. Après 72 heures, la viabilité des hépatocytes sera évaluée à l'aide du dosage MTS. Les résultats seront utilisés pour déterminer les concentrations d'articles de test non toxiques pour les essais d'induction.

Stabilité

En conjonction avec le test de cytotoxicité, des échantillons de milieu sont collectés pour évaluer les concentrations de l'article à tester dans le temps.

Induction d'ARNm CYP

Les hépatocytes de trois donneurs sont incubées en présence ou en l'absence de l'article testé (sept concentrations) ou des inducteurs témoins (voir ci-dessous) dans des puits triples pendant 72 heures dans un incubateur humidifié à 37 °C dans 5 % de CO2, avec un échange de milieu ± article à tester ou témoins toutes les 24 heures. 72 heures plus tard, l'ARNm est extrait et l'expression des gènes déterminée par PCR quantitative en temps réel. Le niveau de chaque ARNm CYP est normalisé au niveau de celui d'un gène de contrôle endogène (ex. GAPDH). L'induction de l'expression du gène CYP est ensuite calculée à l'aide de la méthode 2-ΔΔCT. Les augmentations des niveaux d'ARNm CYP en fonction de l'article testé ≥2 fois par rapport au véhicule témoin, ou une réponse ≥20 % de la réponse des contrôles positifs, peuvent être interprétées comme des résultats positifs.

Induction de l'enzyme CYP

Les hépatocytes de trois donneurs sont cultivés en présence ou en l'absence de l'article testé (trois concentrations) ou des inducteurs de contrôle (comme ci-dessus) dans des puits triples pendant 72 heures dans un incubateur humidifié à 37 °C dans 5 % de CO2, avec des échanges des milieux ± article testé ou témoins se produisant toutes les 24 heures. 72 heures plus tard, les hépatocytes sont incubés dans un nouveau milieu contenant des substrats CYP appropriés (voir ci-dessous) pendant 2 heures, après quoi les réactions sont terminées et des échantillons sont prélevés pour l'analyse des métabolites (voir ci-dessous) en utilisant une méthode d'analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS). Les augmentations de l'activité enzymatique du CYP en fonction de l'article testé ≥2 fois par rapport au véhicule témoin, ou une réponse ≥20 % de la réponse des contrôles positifs, peuvent être interprétées comme des résultats positifs.

			Dosages de l'activité enzymatique
Enzyme CYP	Inducteur	Non-inducteur	Substrat	Analyte
CYP1A2	Oméprazole	Flumazénil	Phénacétine	Acétaminophène
CYP2B6	Phénobarbital	Flumazénil	Bupropion	Hydroxybupropion
CYP3A4/5	Rifampicine	Flumazénil	Midazolam	1’-Hydroxymidazolam

Livrables

Ces dosages fourniront les niveaux d'ARNm et d'activité enzymatique par rapport aux inducteurs connus des enzymes CYP. L'EC₅₀ et l'E_max seront fournies le cas échéant.

En cas de résultats positifs, la pharmacométrie pourra donner des renseignements supplémentaires au moment d'évaluer le besoin de réaliser un essai clinique.

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