- Système de test : pool plasmatique de chaque espèce ou solutions de protéines plasmatiques spécifiques (par exemple, albumine de sérum humain, α1-glycoprotéine acide, gamma-globuline)
- Les concentrations sont choisies pour délimiter des expositions cliniques connues (0,1 - 10X Cmax), sauf si elles sont limitées par la solubilité
Dialyse à l'équilibre
La dialyse à l'équilibre est réalisée à l'aide d'un appareil de dialyse à haut débit (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT). Une matrice fortifiée (plasma ou protéine plasmatique isolée) est ajoutée à la chambre du donneur tandis que la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) est ajoutée à la chambre de réception de chaque puits. Les plaques sont ensuite scellées avec une membrane perméable aux gaz et incubées à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant le temps indiqué (voir ci-dessous). Après incubation, les échantillons de chaque chambre sont analysés par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS).
- Stabilité dans la matrice : l'article testé est incubé dans du plasma et de la DPBS à une concentration unique pouvant aller jusqu'à cinq points dans le temps
- Temps à l'équilibre : l'article testé est ajouté au plasma à une concentration unique et dialysé contre le DPBS pendant un maximum de cinq points dans le temps.
- Dépendance à la concentration de la liaison aux protéines : L'article testé est ajouté au plasma à trois concentrations et dialysé contre le DPBS pendant le temps nécessaire pour atteindre l'équilibre.
- Un témoin positif comme la warfarine est testé en parallèle en dialyse d'équilibre pendant 5 heures ou plus.
Ultrafiltration
Du plasma fortifié sera ajouté à la partie réservoir de l'échantillon d'un dispositif d'ultrafiltration avec un seuil de coupure au poids moléculaire de 30 000 Da. Les échantillons seront centrifugés à 37 °C et 2 000 × g pendant 15 minutes (ou toutes autres conditions appropriées). Après la centrifugation, l'ultrafiltrat sera analysé par LC-MS pour déterminer les concentrations de l'article testé par rapport aux concentrations initiales. Toutes les déterminations des liaisons protéiques seront réalisées en triple.
- Liaison non spécifique : l'article testé est ajouté pour contrôler l'ultrafiltrat de plasma (PUF) à deux concentrations et centrifugé selon la procédure d'ultrafiltration. Le dialysat sera analysé pour déterminer la récupération de l'article testé et la possibilité de liaison non spécifique en l'absence de plasma.
- Dépendance à la concentration de la liaison aux protéines : l'article testé est ajouté au plasma à cinq concentrations et centrifugé selon la procédure d'ultrafiltration. L'ultrafiltrat sera analysé à la recherche de l'article testé.
Ultracentrifugation
Du plasma fortifié sera ajouté aux tubes d'ultracentrifugeuse et centrifugé à 37 ºC à 223 000 × g pendant 4 heures (ou d'autres conditions appropriées) pour obtenir la séparation de l'ultracentrifugat du plasma des protéines plasmatiques. Après centrifugation, l'ultracentrifugé sera analysé par LC-MS et comparé aux concentrations initiales.
- Liaison non spécifique : l'article test est ajouté pour contrôler le plasma humain et l'ultrafiltrat de plasma (PUF) à deux concentrations et incubé dans des tubes d'ultracentrifugation pendant 4 heures. La matrice sera analysée pour déterminer la récupération de l'article testé et la liaison potentielle non spécifique en l'absence de plasma.
- Dépendance de la liaison protéique à la concentration : l'article test est ajouté au plasma à cinq concentrations et centrifugé selon le procédé d'ultracentrifugation. L'ultracentrifugé sera analysé à la recherche de l'article testé.