Phénotypage des réactions

la conformité réglementaire

Évaluation exhaustive des enzymes

Inhibiteurs chimiques spécifiques aux isoformes et enzymes recombinantes

Les études de phénotypage des réactions évaluent l'impact des inhibiteurs spécifiques des isoformes enzymatiques sur la disparition d'un article test parent incubé dans des microsomes hépatiques humains regroupés. L'incubation avec des isoformes enzymatiques recombinantes individuelles du métabolisme des médicaments permet de confirmer les activités enzymatiques.

L'évaluation des enzymes responsables du métabolisme d'un article testé peut mettre en évidence des risques potentiels tels que les voies métaboliques catalysées par des enzymes uniques ou par des enzymes à expression polymorphe.

Considérations réglementaires pour les études de phénotypage des réactions

La recherche sur les enzymes CYP (CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6 et CYP3A) est recommandée comme recherche initiale pour mieux comprendre les voies de clairance du médicament selon les directives relatives aux interactions médicamenteuses (IM). Si ces principales enzymes CYP ne sont pas impliquées dans le métabolisme du médicament, il convient alors d'évaluer d'autres enzymes de phase I et de phase II, notamment :

Les enzymes CYP (CYP2A6, CYP2J2, CYP4F2 et CYP2E1)
Les enzymes ne faisant pas partie du groupe CYP, y compris l'aldéhyde oxydase (AO), la carboxylestérase (CES), la monoamine oxydase (MAO), la flavine monooxygénase (FMO), la xanthine-oxydase (XO) et l'alcool/aldéhyde déshydrogénase (ADH/ALDH)
Les enzymes conjuguées, y compris les UDP glucuronosyl transférases (UGT) et les sulfotransférases (SULT)

Le phénotypage des réactions fournit des informations concernant la fraction métabolisée des articles testés et peut être utilisé pour évaluer le risque d'interaction médicamenteuse, guider la conception des études cliniques, prédire la variabilité individuelle de la pharmacocinétique et évaluer l'impact du polymorphisme génétique.

Méthodes

Système de test : regroupement de microsomes hépatiques humains et d'enzymes humaines recombinantes exprimées individuellement avec les cofacteurs requis
Isoformes CYP : CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 et CYP3A4. (D'autres CYP, UGT et enzymes du métabolisme des médicaments sont également disponibles).
Des inhibiteurs chimiques spécifiques aux isoformes et des enzymes recombinantes sont utilisés pour la confirmation.

L'article testé est préincubé pendant au moins 5 minutes avec des microsomes dans un tampon de phosphate. Le métabolisme de l'article testé est déclenché par l'ajout de NADPH ou d'un autre cofacteur approprié. Les incubations sont interrompues en ajoutant un solvant organique, les échantillons sont ensuite analysés pour l'article testé et/ou ses métabolites par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS).

Phase I – Optimisation des conditions d'incubation in vitro

L'article testé est incubé en trois exemplaires avec une gamme de concentrations de microsomes (généralement 0,1 – 1 mg de protéine/ml) pendant quatre intervalles de temps allant jusqu'à 60 minutes en présence de NADPH ou d'un autre cofacteur adapté.

Des incubations de contrôle sont réalisées en l'absence de cofacteur. Les conditions d'incubation de la concentration microsomale et le moment de l'incubation qui produisent un taux linéaire de disparition des articles testés sont utilisés pour définir les expériences de suivi.

Phase II – Analyse cinétique du métabolisme des articles testés

La rapidité avec laquelle l'article testé disparaît est contrôlée dans les échantillons d'incubation avec au moins huit concentrations de l'article testé en trois exemplaires dans des conditions optimisées. Les données sont analysées en utilisant l'ajustement de la courbe de Michaelis-Menten et les paramètres cinétiques K_m et V_max sont déterminés pour l'article testé.

Phase III – Analyse de l'inhibition à l'aide d'inhibiteurs chimiques propres à la CYP

L'article testé est incubé en trois exemplaires, à une concentration <Km, avec des microsomes hépatiques humains regroupés, en l'absence ou en présence des inhibiteurs chimiques à sélectivité enzymatique. Les incubations de contrôle sont effectuées en l'absence de l'inhibiteur uniquement à l'aide du solvant du véhicule.

Phase IV – Métabolisme utilisant des CYP humaines recombinantes

L'article testé est incubé en trois exemplaires à une concentration <Km avec une gamme de CYP et UGT humaines recombinantes, et d'autres enzymes du métabolisme des médicaments (voir ci-dessus). La concentration relative de l'article testé à 0 et 60 minutes est mesurée.

Livrables

Ces dosages permettront d'identifier les enzymes responsables et l'étendue du métabolisme de l'article testé in vitro. La cinétique de la disparition de l'article testé et/ou de la formation de métabolites est déterminée. L'évaluation du métabolisme in vitro identifie les principales enzymes impliquées et vous avertit des risques potentiels liés au mécanisme de clairance in vivo avant les premiers essais sur l'homme.

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